一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌动物模型的建立方法技术

本发明专利技术提供了一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌动物模型的建立方法，该方法包括以下步骤：建立小鼠舌鳞癌细胞系；将小鼠舌鳞癌细胞与水凝胶微球载体共培养得到载细胞微球；取载细胞微球接种在同品系小鼠的舌根部，建立同源免疫小鼠原位舌癌动物模型。本发明专利技术通过三维载体培养癌细胞构建的同源免疫原位成瘤动物模型能更好地再现舌癌的临床特点并反映其肿瘤微环境以及物理、生理、化学等特性，为舌癌的防治提供更好的动物实验基础，可用于抗肿瘤化疗药物的筛选，还可以进行免疫治疗、内分泌治疗、放疗、分子靶向治疗等新治疗手段的研究。研究。研究。

【技术实现步骤摘要】
一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌动物模型的建立方法


[0001]本专利技术涉及基于小鼠自发成瘤、舌鳞癌细胞系建立、舌鳞癌水凝胶微球载体构建、小鼠舌根原位注射的舌鳞状细胞癌动物模型构建方法。

技术介绍

[0002]近年来，随着医学研究的不断推进，口腔颌面部鳞状细胞癌(OSCC)的诊疗水平得到显著提升，但仍有超过1/3的病人5年内死于肿瘤的局部复发和(或)远处转移。因此，全面提高OSCC的治愈率及有效预防仍是一重大临床难题。
[0003]研究者为了更好地研究口腔癌的发生、发展机制，改善该病的预防和治疗手段，常借助于肿瘤动物模型间接研究并评估各种治疗效果以及验证相关分子机制。然而，现存的肿瘤研究动物模型，包括移植、化学诱导、基因敲除动物模型等，建立的临床前模型均存在不足之处。传统的裸鼠移植瘤模型包括皮下移植及原位移植，由于其免疫缺陷，不适合做肿瘤免疫治疗和生物治疗相关的研究；化学诱导动物模型如4
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NQO诱导小鼠，其体细胞突变不可控，形成的瘤体均一性较差；基因敲除动物模型，因其过度丰富的转基因表达可能导致非口腔肿瘤的发生，且不能模仿自发性癌症的多基因改变。
[0004]任国欣等于2016年提出了一种兔舌癌动物模型的建立方法，该方法建立具有高淋巴结转移潜能的舌癌动物模型，完整再现舌癌的临床特点及淋巴结转移生物学特性，为舌癌的预防及治疗提供更好的实验基础。但该方法操作步骤过于繁琐，完成构建所需的实验动物量大，不利于可持续的实验研究。

技术实现思路

[0005]针对上述背景技术中存在的缺陷，本专利技术提供了一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌模型的构建方法。本专利技术提出的同源免疫小鼠舌癌动物模型巧妙地利用水凝胶微球载体构建技术，在有效弥补上述不足的同时，又能简便高效地实现免疫小鼠舌根部鳞癌的模型构建。其优势体现在原位成瘤并使成瘤时间大大缩短，均一性好且更贴近临床理化特性，有效建立便于抗肿瘤药物筛选与免疫治疗的临床前模型，进一步推动口腔鳞癌的临床研究。
[0006]本专利技术的一个目的是提供一种舌癌小型动物原位肿瘤模型，包括化学诱导小鼠舌部鳞癌形成，建立小鼠舌鳞状细胞系，将小鼠舌鳞癌细胞与水凝胶微球共培养得到载细胞微球，同源遗传背景鼠舌根部定位载细胞微球移植。
[0007]一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌动物模型的建立方法，包括以下步骤：
[0008]步骤S1：建立小鼠舌鳞癌细胞系；
[0009]步骤S2：将小鼠舌鳞癌细胞与水凝胶微球共培养得到载细胞微球；
[0010]步骤S3：将载细胞微球接种在同品系小鼠的舌根部，建立同源免疫小鼠舌癌动物模型。
[0011]上述技术方案中，进一步地，所述步骤S1具体为：
[0012]选取4周龄的C57BL/6雄性小鼠，在SPF条件下饲养；
[0013]4‑
NQO化学诱导建立舌根部鳞癌动物模型；
[0014]取舌根部鳞癌以贴块法和消化法进行原代培养；
[0015]原代培养首次传代后用反复贴壁和胰酶消化法交替进行纯化，得到小鼠舌鳞癌细胞系。
[0016]进一步地，所述4
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NQO化学诱导建立舌根部鳞癌动物模型的具体方法为：4
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NQO(200ug/ml)加入C57BL/6小鼠饮水中中饲养16周。
[0017]进一步地，步骤S1中，所述原代培养的条件为：在5％CO2、37℃培养箱内的DMEM/F12胎牛血清培养基中培养。
[0018]进一步地，步骤S1中，所述原代培养首次传代后用反复贴壁和胰酶消化法交替进行纯化的过程中，在传代时用0.02％的EDTA和0.25％胰蛋白酶1∶4的混合液在37℃温箱内孵育5min。
[0019]进一步地，所述步骤S2具体为：
[0020]取分离纯化的小鼠舌鳞癌细胞稳定传代；
[0021]制作水凝胶微球并对其进行活化；
[0022]将20
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25代的小鼠舌鳞癌细胞与活化水凝胶微球悬浮培养，得到载细胞微球。
[0023]进一步地，所述步骤S2中，制作水凝胶微球并对其进行活化，具体为：
[0024]制备水凝胶微球：每1g GelMA胶原与0.1g LAP引发剂混合溶于20ml 0.5％w/v海藻酸钠中，55℃水浴溶解；制备5％w/v CaCl2接收液；利用电喷打印制备直径为200
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300μm的水凝胶微球，采用CaCl2接收液接收并用405nm光固化灯固化60s后，4℃保存；
[0025]活化水凝胶微球：弃去CaCl2接收液，PBS冲洗，加入5ml 4％w/v枸橼酸，放入37℃120rpm摇床上振荡30min；酒精消毒离心管后拿入无菌操作台，静置5
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10min等待微球沉降完成；弃去4％w/v枸橼酸，PBS冲洗后加入75％酒精，使其与水凝胶微球充分接触，紫外照射30min；弃去75％酒精，加入PBS没过水凝胶微球，紫外照射5
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10min；PBS洗涤2遍后，吸取水凝胶微球溶液至低吸附六孔板中并轻轻摇匀；最后弃去孔板内PBS，加入10％胎牛血清的高糖DMEM培养基；平置入5％CO2、37℃细胞培养箱过夜，得到活化水凝胶微球。
[0026]进一步地，将小鼠舌鳞癌细胞与活化水凝胶微球悬浮培养的过程中，取小鼠舌鳞癌细胞消化、离心、收集细胞，计数板上计数，用10％胎牛血清的高糖DMEM培养基制成细胞悬液，以1X106/孔接种于平铺有一层预处理后的水凝胶微球的低吸附六孔板中，培养48小时得到载细胞微球。
[0027]进一步地，所述步骤S3具体为：
[0028]选取4周龄的C57BL/6雄性小鼠，在SPF条件下饲养；
[0029]将载细胞微球接种在同品系小鼠舌根部，建立同源免疫小鼠舌癌动物模型。
[0030]进一步地，将所述载细胞微球接种在小鼠舌根部的步骤中，接种的具体位置为舌后三分之一的舌体实质内。
[0031]进一步地，所述载细胞微球以2.5X107细胞数接种于小鼠舌根部。
[0032]与现有技术相比，本专利技术技术方案的有益效果是：
[0033](1)成瘤时间缩短，成瘤率提升，肿瘤均一性好；
[0034](2)本专利技术的同源免疫小鼠舌癌动物模型可进行抗肿瘤药物筛选与免疫治疗、内分泌治疗、放疗、分子靶向治疗等相关研究；
[0035](3)本专利技术利用三维水凝胶微球载体培养癌细胞构建的同源免疫小鼠舌癌动物模型，能更好地模拟肿瘤微环境，更贴近临床肿瘤的物理、生理、化学等理化特性，可以为舌癌的防治提供更好的动物实验基础，提高研究的准确性。
附图说明
[0036]图1是本专利技术一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌动物模型的建立方法示意图；
[0037]图2是本专利技术建立的小鼠舌鳞状细胞癌细胞系的细胞形态光镜下成像及免疫荧光成像示意图；
[0038]图3是本专利技术水凝胶微球载体和载细胞微球的形态光镜下成像及载细胞微球本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1：建立小鼠舌鳞癌细胞系；步骤S2：将小鼠舌鳞癌细胞与水凝胶微球共培养得到载细胞微球；步骤S3：将载细胞微球接种在同品系小鼠的舌根部，建立同源免疫小鼠舌癌动物模型。2.如权利要求1所述的一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：选取4周龄的C57BL/6雄性小鼠，在SPF条件下饲养；4
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NQO化学诱导建立舌根部鳞癌动物模型；取舌根部鳞癌以贴块法和消化法进行原代培养；原代培养首次传代后用反复贴壁和胰酶消化法交替进行纯化，得到小鼠舌鳞癌细胞系。3.如权利要求2所述的一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，步骤S1中，所述原代培养的条件为：在5％CO2、37℃培养箱内的DMEM/F12胎牛血清培养基中培养。4.如权利要求2所述的一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，步骤S1中，所述原代培养首次传代后用反复贴壁和胰酶消化法交替进行纯化的过程中，在传代时用0.02％的EDTA和0.25％胰蛋白酶1∶4的混合液在37℃温箱内孵育5min。5.如权利要求2所述的一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：取分离纯化的小鼠舌鳞癌细胞稳定传代；制作水凝胶微球并对其进行活化；将20
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25代的小鼠舌鳞癌细胞与活化水凝胶微球悬浮培养，得到载细胞微球。6.如权利要求5所述的一种基于载细胞微球的同源免疫小鼠舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤S2中，制作水凝胶微球并对其进行活化，具体为：制备水凝胶微球：每1g GelMA胶原与0.1g LAP引发剂混合溶于20ml 0.5％w/v海藻酸钠中，55℃水浴溶解；制备5％w/v CaCl2接收液；利用电喷打印制备直径为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞梦飞，朱子羽，周思怡，顾天忆，孔建鲁，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：