一种用于原发免疫性血小板减少症检测的生物标志物及其试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物医学诊断领域，具体涉及一种用于原发免疫性血小板减少症检测的生物标志物及其试剂盒。所述生物标志物为干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白1B（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 1B，IFIT1B）、癌胚抗原相关细胞黏附分子6（carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 6，CEACAM6）、血型糖蛋白B（glycophorin B，GYPB）、碳酸酐酶1（carbonic anhydrase 1，CA1）、二磷酸甘油酸变位酶（bisphosphoglycerate mutase，BPGM）中的一种、两种或两种以上的组合。该生物标志物能够对ITP进行检测，准确率高、检测速度快、成本低、创伤小，易于被受试者接受，为ITP提供了科学有效的诊断方案。该试剂盒可以在大范围内筛查ITP，并且只需采集外周血即可完成检测，使得大范围的检测成为可能。范围的检测成为可能。范围的检测成为可能。

【技术实现步骤摘要】
一种用于原发免疫性血小板减少症检测的生物标志物及其试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学诊断领域，具体涉及一种用于原发免疫性血小板减少症检测的生物标志物及其试剂盒。

技术介绍

[0002]原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia, ITP）既往亦称特发性血小板减少性紫癜，是一种获得性自身免疫性出血性疾病，约占出血性疾病总数的1/3，成人的年发病率为5
‑
10/10万，育龄期女性发病率高于同年龄组男性，60岁以上老年人是该病的高发群体。临床表现以皮肤黏膜出血为主，严重者可发生内脏出血，甚至颅内出血，出血风险随年龄增长而增加。部分患者仅有血小板减少而没有出血症状。部分患者有明显的乏力症状。
[0003]该病主要发病机制是由于患者对自身抗原的免疫失耐受，导致免疫介导的血小板破坏增多和免疫介导的巨核细胞产生血小板不足。阻止血小板过度破坏和促进血小板生成是ITP现代治疗不可或缺的重要方面。
[0004]申请公布号为CN109207585A的文件公开了免疫性血小板减少症lncRNA标志物为LOC00506314及其碱基序列，lncRNA标志物的引物的碱基序列以及作为试剂盒的应用。但是采用单一的标志物进行检测诊断发生假阴性和假阳性的非真实情况概率较大，对临床诊断造成的危害不可忽视。

技术实现思路

[0005]针对上述存在的问题，本专利技术的目的是提供一种用于原发免疫性血小板减少症检测的生物标志物及其试剂盒，利用两种或两种以上生物标志物的组合来实行对原发免疫性血小板减少症的检测，具有更高的灵敏度和特异度，提高了诊断效能。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术一方面提供一种用于原发免疫性血小板减少症检测的生物标志物，所述生物标志物为干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白1B（interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 1B，IFIT1B）、癌胚抗原相关细胞黏附分子6（carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 6，CEACAM6）、血型糖蛋白B（glycophorin B，GYPB）、碳酸酐酶1（carbonic anhydrase 1，CA1）、二磷酸甘油酸变位酶（bisphosphoglycerate mutase，BPGM）中的一种、两种或两种以上的组合。
[0007]作为本专利技术的进一步优选，干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白1B的水平、癌胚抗原相关细胞黏附分子6的水平、血型糖蛋白B的水平、碳酸酐酶1的水平、二磷酸甘油酸变位酶的水平与原发免疫性血小板减少症的发生呈正相关。
[0008]本专利技术第二方面提供上述生物标志物在制备用于检测原发免疫性血小板减少症的试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术第三方面提供一种用于原发免疫性血小板减少症检测的试剂盒，所述试剂
盒包括检测干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白1B水平的物质、癌胚抗原相关细胞黏附分子6水平的物质、血型糖蛋白B水平的物质、碳酸酐酶1水平的物质、二磷酸甘油酸变位酶水平的物质中的一种、两种或两种以上的组合。
[0010]作为本专利技术的进一步优选，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书用于记载使用方法。
[0011]作为本专利技术的进一步优选，所述说明书记载的使用方法包括以下步骤：步骤一：使用试剂盒测定来自受试者的生物样品中的干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白1B的水平、癌胚抗原相关细胞黏附分子6的水平、血型糖蛋白B的水平、碳酸酐酶1的水平、二磷酸甘油酸变位酶的水平中的一种、两种或两种以上的组合；步骤二：基于步骤一测定的生物标志物水平测定原发免疫性血小板减少症，其中，干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白1B的水平、癌胚抗原相关细胞黏附分子6的水平、血型糖蛋白B的水平、碳酸酐酶1的水平、二磷酸甘油酸变位酶的水平中的任意一种相对于参比水平上调、或者上述两种组合相对于参比水平上调、或者上述两种以上的组合相对于参比水平上调，表明该受试者具有原发免疫性血小板减少症。
[0012]作为本专利技术的进一步优选，所述参比水平为不具有原发免疫性血小板减少症的群体获得的平均水平。
[0013]本专利技术第四方面提供上述试剂盒在原发免疫性血小板减少症检测中的应用。
[0014]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了能够用于原发免疫性血小板减少症（ITP）检测的存在于血小板中的生物标志物，准确率高、检测速度快、成本低、创伤小，易于被受试者接受，为ITP提供了科学有效的诊断方案。
[0015]本专利技术提供了检测原发免疫性血小板减少症（ITP）的试剂盒，该试剂盒可以在大范围内筛查ITP，并且只需采集外周血即可完成检测，使得大范围的检测成为可能。
附图说明
[0016]附图1为本专利技术的差异基因火山图。
[0017]附图2为本专利技术五个标志物的特异性ROC曲线图。
[0018]附图3为本专利技术四组包含两个组合标志物的特异性ROC曲线图。
[0019]附图4为本专利技术三组包含三个组合标志物的特异性ROC曲线图。
[0020]附图5为本专利技术五种基因的qPCR引物进行qPCR基因拷贝数检测图。
具体实施方式
[0021]实施例1.血小板分离和RNA提取收集64例ITP患者和63例健康人。血小板减少症定义为血小板计数＜100
×
10
9 个血小板/升。如果患者携带这些并发症，即糖尿病、高血压、心血管疾病、妊娠、活动性感染或 ITP 以外的自身免疫性疾病，则被排除在样本纳入之外。
[0022]在收集后 24 小时内从样品中分离血小板：a.以尽量减少血小板 RNA 质量和数量的损失对富含血小板血浆（PRP）在 1000rpm的离心步骤分离；b.抽取的PRP并转移到1.5ml Eppendorf 管中，然后通过20分钟3000rpm的离心步骤使血小板沉淀，随后除去上清
液，观察到血小板为白色沉淀；c.使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液洗涤血小板，然后在15分钟3000rpm离心步骤后将其去除，之后进行瞬时离心，并去除残留的PBS溶液。沉淀的血小板使用TRIzol 试剂（Invitrogen）处理纯化总 RNA。
[0023]实施例2. 文库构建和 mRNA 测序样品检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物的mRNA：a.加入fragmentation buffer将mRNA随机打断，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成 cDNA第一链，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成cDNA第二链，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA；b.纯化的双链 cDNA进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads 进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的 cDNA 文库；c.库检合格后，不同文库按照有效浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于原发免疫性血小板减少症检测的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白1B、癌胚抗原相关细胞黏附分子6、血型糖蛋白B、碳酸酐酶1、二磷酸甘油酸变位酶中的一种、两种或两种以上的组合。2.根据权利要求1所述的一种用于原发免疫性血小板减少症检测的生物标志物，其特征在于，干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白1B的水平、癌胚抗原相关细胞黏附分子6的水平、血型糖蛋白B的水平、碳酸酐酶1的水平、二磷酸甘油酸变位酶的水平与原发免疫性血小板减少症的发生呈正相关。3.权利要求1所述的生物标志物在制备用于检测原发免疫性血小板减少症的试剂盒中的应用。4.一种用于原发免疫性血小板减少症检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测干扰素诱导的三角形四肽重复蛋白1B水平的物质、癌胚抗原相关细胞黏附分子6水平的物质、血型糖蛋白B水平的物质、碳酸酐酶1水平的物质、二磷酸甘油酸变位酶水平的物质中的一种、两种或两种以上的组合。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括说明书，所述说明...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑森，胡朝阳，
申请(专利权)人：浙江丰能医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：