MGB探针溶解方法及其溶液技术

本发明专利技术提供MGB探针溶解方法，所述MGB探针在实时荧光定量PCR反应中应用，所述MGB探针包含至少4个连续鸟嘌呤，向所述MGB探针中加入1

【技术实现步骤摘要】
MGB探针溶解方法及其溶液


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及MGB探针溶解方法及其溶液。

技术介绍

[0002]MGB（minor groove binding，小沟结合淬灭剂）核酸探针，一般指的是核酸探针的3
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端标记小沟结合剂（minor groove binder）的单链核酸。小沟结合剂具有大的共轭结构以及小沟嵌合结构，跟双链DNA有更好的结合力，从而可以提高核酸探针的Tm值，因此3
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端用MGB作为淬灭基团的荧光探针，序列可以比常规Taqman探针设计的更短，从而更好的淬灭5
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端荧光修饰产生的荧光信号。MGB探针具有荧光本底更低，更高的灵敏度和特异性等特点，广泛应用于基因分析和基因表达等领域。但是由于MGB的结构特征导致疏水性强（如式1所示），这类MGB探针在常规的溶解体系（超纯水/1
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TE缓冲液）中，溶解度较差。
[0003]式1在设计实时荧光定量PCR反应所需的MGB探针时，针对特定的检测位点，有时会存在探针序列中出现连续4个及以上鸟嘌呤（dG）的情况，通常将这类探针称为Poly(dG)MGB探针。鸟嘌呤（dG）是一个能够自我结合、自我组装的核酸碱基，探针序列中连续的4个鸟嘌呤可通过氢键作用力形成一个相互连接的刚性结构（式2所示），具有这种结构的探针溶解度比较差，再加上MGB类探针溶解性本身就较差，Poly(dG)MGB探针就更加难以溶解。从而导致后续QPCR测试过程中荧光信号值降低或荧光不稳定的情况。
[0004]式2。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种在实时荧光定量PCR反应中应用的MGB探针溶解方法。
[0006]在一种实施方式中，本专利技术提供一种MGB探针溶解方法，所述MGB探针在实时荧光定量PCR反应中应用，所述MGB探针包含至少4个连续鸟嘌呤，向所述MGB探针中加入1
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TE缓冲液，70℃
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80℃条件下加热振荡溶解，然后添加10%
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30%体积比例甲酰胺或添加比例15%
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30%体积比例乙酰胺。
[0007]在一种实施方式中，添加10%
‑
15%体积比例甲酰胺。
[0008]在一种实施方式中，添加15%体积比例甲酰胺。
[0009]在一种实施方式中，70℃
‑
80℃条件下加热振荡溶解1
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3分钟。
[0010]在一种实施方式中，70℃条件下加热振荡溶解3分钟。
[0011]在一种实施方式中，所述MGB探针的荧光基团包括FAM、VIC、HEX、ROX和CY5。
[0012]在一种实施方式中，提供上述方法制备的MGB探针溶液。
[0013]本专利技术方法适用于序列中含有Poly(dG)MGB探针的溶解，能够充分溶解这类核酸探针。本专利技术通过引入甲酰胺添加剂，增大了序列中含有Poly(dG)MGB探针的溶解度，使得含有Poly(dG)MGB探针溶解度提高；避免了MGB探针中Poly(dG)结构对于溶解度影响，避免了溶解后探针的析出，使其在QPCR过程中更加稳定，且该添加剂对QPCR实验不会造成影响，对于QPCR反应信号起到增强作用。
[0014]具体实施方式
[0015]为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本专利技术作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
[0016]实施例一对于含Poly(dG)MGB探针的溶解测试对于含Poly(dG)MGB探针的溶解度进行探究，合成探针序列信息如表1所示，详细的操作步骤如下：1. 取200nmol含MGB淬灭基团的固相载体CPG，装入合成柱管中制成固相合成柱，装载至寡核苷酸自动合成仪的柱座上。
[0017]2. 准备合成使用的脱保护剂、活化耦合剂、盖帽剂、氧化剂，其中脱保护剂为3%(w/v)三氯乙酸的二氯甲烷溶液，每次使用量为200ul；活化耦合剂为0.25M乙巯基四氮唑的乙腈溶液，每次使用量为75ul；盖帽剂CAP A为10%(v/v)乙酸酐的四氢呋喃溶液，每次使用量为80ul，盖帽剂CAP B为16%(v/v)1
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甲基咪唑的四氢呋喃溶液，每次使用量为80ul，盖帽剂CAP A和盖帽剂CAP B由机器自动同时加入到合成柱中；氧化剂为0.05M MGB专用碘试剂，每次使用量为150ul。用450ml无水乙腈溶解20g DNA亚磷酰胺单体并用氩气保护，每次使用量为63ul，用4.5ml无水乙腈溶解250mg 6
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荧光素亚磷酰胺单体（FAM），每次使用量为80ul；将上述所有合成试剂装载至寡核苷酸自动合成仪上。
[0018]3. 将表1中的探针序列导入寡核苷酸自动合成仪中并核对；清洗合成仪设备管道并预打管道流量；检查设备压力、试剂瓶压力、试剂用量等参数，确认无误后点击“开始合成”按钮开始合成。
[0019]4. 合成过程中检查试剂用量和设备运行状态直至合成结束。
[0020]5. 合成结束后采用水浴氨解脱保护，将合成结束后连接有MGB探针的CPG粉末放入1 ml浓氨水（28%）中加热至55℃，反应8小时，反应结束后冷却至室温。
[0021]6. 过滤去除CPG粉末，将含有MGB探针的过滤液装载至高效液相色谱仪上，采用乙腈与0.1M 三乙胺醋酸盐（TEAA）水溶液进行纯化。通过比例阀调节在30min内乙腈的比例从2%提升至35%，而0.1M 三乙胺醋酸盐（TEAA）水溶液的比例从98%下降至65%，纯化得到高纯度的含有机相的Poly(dG)MGB探针溶液。
[0022]7．取10ul上述MGB探针溶液，用超纯水稀释至100ul，装载至高效液相色谱仪上进行纯度分析。
[0023]8. 从得到的高纯度的Poly(dG)MGB探针溶液中取2ul使用Nanodrop one分光光度计测量A
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的吸光值，转换为nmol值，按照每管50nmol分装至2mL透明离心管中；9. 将分装完成的Poly(dG)MGB探针无损冻干；10. 在干粉状的Poly(dG)MGB探针中分别加入500ul的1
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TE缓冲液，溶解后的理论浓度是100uM。一般来说，普通探针在1分钟内就可以通过振荡溶解完全，但本实施例溶解过程中，发现探针溶解很不彻底，因此统一采用旋涡振荡仪在室温下振荡30分钟。
[0024]11. 振荡结束后使用Nanodrop one分光光度计测量溶液的吸光值，并转化成nmol值。
[0025]12. 取10ul上述MGB探针溶液，用水稀释至100ul，装载至高效液相色谱仪上再本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.MGB探针溶解方法，其特征在于，所述MGB探针在实时荧光定量PCR反应中应用，所述MGB探针包含至少4个连续鸟嘌呤，向所述MGB探针中加入1
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TE缓冲液，70℃
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80℃条件下加热振荡溶解，然后添加10%
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30%体积比例甲酰胺或添加比例15%
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30%体积比例乙酰胺。2.根据权利要求1所述的MGB探针溶解方法，其特征在于，添加10%
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15%体积比例甲酰胺。3.根据权利要求2所述的MGB探针溶解方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏敏，王舒心，蔡晶晶，李俊，
申请(专利权)人：百力格生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：