一种高效生产脐带间充质干细胞来源的外泌体的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效生产脐带间充质干细胞来源的外泌体的方法，包括以下步骤：(1)、在体外培养时，将脐带间充质干细胞使用培养基A在低氧细胞培养箱内进行培养；(2)、待细胞融合至55～65％时，去除杂质，分离出培养上清液；(3)、将培养上清液移入无血清培养基中继续在低氧细胞培养箱内进行培养，直至细胞融合至至少95％，去除杂质，分离出细胞培养上清液；(4)、对细胞培养上清液预处理，得到含有外泌体的离心液；(5)、将含有外泌体的离心液置于外泌体提取系统进行纯化后即得到脐带间充质干细胞来源的外泌体纯化液。本发明专利技术可以在短时间内获得高纯度，高产量且均一性良好的的脐带间充质干细胞来源外泌体。细胞来源外泌体。细胞来源外泌体。

【技术实现步骤摘要】
一种高效生产脐带间充质干细胞来源的外泌体的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，特别涉及一种高效生产脐带间充质干细胞来源的外泌体的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)来源于中胚层，理论上这种类型的细胞可以分化为中胚层的组织细胞，且具有很强的增殖能力和多向分化能力。
[0003]间充质干细胞在人体内来源甚广，如脐带、胎盘，脂肪，骨髓，牙髓，脐带血等，在体外可以进行大规模的扩增。间充质干细胞具有很强的免疫调节功能，能够有效的促进机体内造血功能的恢复。同时能够在体内外特定条件下分化成骨细胞(Osteoblast)，脂肪细胞(Adipocyte)，成软骨细胞(Chondrocyte)，肌细胞(Myocyte)，神经细胞(Neuron)等多种组织细胞，对病变组织器官的修复起促进作用。在多种疾病的临床应用中展现出极佳的应用前景。但由于间充质干细胞属于活细胞产品，还存在一些临床使用方面的问题，如活细胞临床应用的长期安全性，有些病人体内出现细胞宿主抗体等。
[0004]近些年的研究发现间充质干细胞除了上述的一些功能外，还向细胞外分泌多种不同粒径的囊泡状结构，如外泌体(粒径：30
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200nm)，微囊泡(粒径：200
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2000nm)和凋亡小体(粒径：500
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2000nm)。其中外泌体最初由Johnstone在研究网织红细胞的过程中被发现的囊性小泡，粒径仅60nm，且囊性小泡表面富含有胆固醇、神经鞘磷脂、神经酰胺等物质，在小泡内部含有许多不同类型蛋白质(生长因子、细胞因子、转录因子和酶等)，脂质(胆固醇，神经鞘磷脂等)，RNA物质(LincRNAs,mRNAs和microRNAs)以及信号分子等具有生物学活性的物质，与细胞表面的膜蛋白结合，将生物学活性物质选择性的递送至受体细胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞信号通路，发挥生物学功能。
[0005]有文献报道脐带间充质干细胞来源的外泌体可发挥抵抗自由基的损伤，激活细胞增殖和迁移，防止细胞凋亡和修复组织损伤等效果，并在多种疾病模型中表现出治疗或缓解的作用，如心肌缺血再灌注损伤，肝脏缺血再灌注损伤，皮肤伤口愈合，支气管肺发育不良，肾损伤，二型糖尿病，炎症性肠病，周围神经损伤和移植物抗宿主病等。间充质干细胞来源外泌体属于细胞衍生物，具有与活细胞相类似的生物学功能，但并无细胞活性，克服了现阶段细胞治疗中的部分缺陷，有望获得极大的临床使用。
[0006]外泌体在临床应用中的质量和数量是首要考虑的问题，目前外泌体的制备方法较多。如连续超速离心(Sequential ultracentrifugation)、梯度超速离心(Gradient ultracentrigugation)、超滤(Ultrafiltration)、尺寸排阻色谱(Size
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exclusion chromatography)。这些方法在制备外泌体时均有一些不足之处：1、连续超速离心和梯度超速离心费时费力，需要使用较大的分离设备，容易产生蛋白质聚集；2、超滤会导致膜堵塞和捕获，进而外泌体纯度收到影响；3、尺寸排阻色谱法需要额外的方法进一步富集外泌体，且设备相对昂贵一些。4、上述几种方法均存在着产量不大的问题。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：为了克服现有技术在间充质干细胞来源外泌体分泌和纯化过程中出现的问题，本专利技术公开了一种高效生产脐带间充质干细胞来源的外泌体的方法。本专利技术创造性的使用血清饥饿法结合低氧法培养间充质干细胞，并在此过程中使用促炎因子预处理间充质干细胞，最后采用深圳汇芯生物科技公司的全自动化外泌体提取系统EXODUS对收获的外泌体进行纯化，获得的外泌体产量高，纯度高，均一性良好。
[0008]技术方案：一种高效生产脐带间充质干细胞来源的外泌体的方法，包括以下步骤：
[0009](1)、在体外培养时，将脐带间充质干细胞使用培养基A在低氧细胞培养箱内进行培养，其中：
[0010]所述培养基A中含有5％浓度的胎牛血清及10ng/mL bFGF；
[0011](2)、观察细胞生长状态，待细胞融合至55～65％时，去除杂质，分离出培养上清液；
[0012](3)、将步骤(2)得到的培养上清液移入无血清培养基中继续在低氧细胞培养箱内进行培养，直至细胞融合至至少95％，去除杂质，分离出细胞培养上清液，其中：
[0013]所述无血清培养基中含有10ng/mL的IL
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6细胞因子、50ng/mL的TNF
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α细胞因子、20ng/mL的HGF细胞因子；
[0014](4)、对步骤(3)得到的细胞培养上清液预处理，得到含有外泌体的离心液；
[0015](5)、将步骤(4)得到的含有外泌体的离心液置于外泌体提取系统进行纯化后即得到脐带间充质干细胞来源的外泌体纯化液。
[0016]进一步地，步骤(1)中低氧细胞培养箱内的氧气浓度为4～6％。
[0017]更进一步地，步骤(1)中低氧细胞培养箱内的氧气浓度为5％。
[0018]进一步地，步骤(1)所述的培养基A中还包括：
[0019]氯化钠6000
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7000mg/L；
[0020]D
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葡萄糖4000
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5000mg/L；
[0021]L
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谷氨酰胺400
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700mg/L；
[0022]甘油100
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150mg/L；
[0023]磷酸二氢钠100
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150mg/L；
[0024]丙酮酸钠100
‑
150mg/L；
[0025]L
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异亮氨酸100
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150mg/L；
[0026]L
‑
亮氨酸100
‑
150mg/L；
[0027]L
‑
苏氨酸80
‑
100mg/L；
[0028]L
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缬氨酸80
‑
100mg/L；
[0029]L
‑
丙氨酸盐酸盐50
‑
70mg/L；
[0030]L
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苯丙氨酸50
‑
70mg/L；
[0031]L
‑
丝氨酸35
‑
55mg/L；
[0032]1，3
‑
丙二醇35
‑
55mg/L；
[0033]甘氨酸25
‑
40mg/L；
[0034]L
‑
色氨酸10
‑
20mg/L；
[0035]苯酚红10
‑
20mg/L；
[0036]叶酸1...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效生产脐带间充质干细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、在体外培养时，将脐带间充质干细胞使用培养基A在低氧细胞培养箱内进行培养，其中：所述培养基A中含有5％浓度的胎牛血清及10ng/mL bFGF；(2)、观察细胞生长状态，待细胞融合至55～65％时，去除杂质，分离出培养上清液；(3)、将步骤(2)得到的培养上清液移入无血清培养基中继续在低氧细胞培养箱内进行培养，直至细胞融合至至少95％，去除杂质，分离出细胞培养上清液，其中：所述无血清培养基中含有10ng/mL的IL
‑
6细胞因子、50ng/mL的TNF
‑
α细胞因子、20ng/mL的HGF细胞因子；(4)、对步骤(3)得到的细胞培养上清液预处理，得到含有外泌体的离心液；(5)、将步骤(4)得到的含有外泌体的离心液置于外泌体提取系统进行纯化后即得到脐带间充质干细胞来源的外泌体纯化液。2.如权利要求1所述的一种高效生产脐带间充质干细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，步骤(1)中低氧细胞培养箱内的氧气浓度为4～6％。3.如权利要求2所述的一种高效生产脐带间充质干细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，步骤(1)中低氧细胞培养箱内的氧气浓度为5％。4.如权利要求1所述的一种高效生产脐带间充质干细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，步骤(1)所述的培养基A中还包括：氯化钠6000
‑
7000mg/L；D
‑
葡萄糖4000
‑
5000mg/L；L
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谷氨酰胺400
‑
700mg/L；甘油100
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150mg/L；磷酸二氢钠100
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150mg/L；丙酮酸钠100
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150mg/L；L
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异亮氨酸100
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150mg/L；L
‑
亮氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕品雷，李文瑞，司家霖，蒙玲莉，黄国军，朱一，
申请(专利权)人：海南启研干细胞抗衰老医院有限公司，
类型：发明
国别省市：