鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的检测方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术公开了一种鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的组合物，包括引物组和探针组，利用结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌以及利福平的耐药位点的特征性序列设计不同的引物和探针，再通过多重荧光PCR扩增即可快速得到检测结果。还公开了包含该组合物的试剂盒。本发明专利技术建立了可快速检测非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的检测方法，该方法操作简单，可快速得到检测结果，满足临床需求。满足临床需求。

【技术实现步骤摘要】
鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的检测方法、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的检测方法、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]结核病(TB)是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tubercμLosis complex， MTBC)引起的传染病，主要影响肺部。MTBC包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberc μLosis，MTB)、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，人肺结核的致病菌90％为结核分枝杆菌。非结核分枝杆菌(non
‑
tuberc Lous mycobacteria，NTM)是分枝杆菌属内除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。NTM可以侵犯人体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组织器官，并可引起全身散播性疾病。
[0003]微生物培养是诊断结核病的金标准，涂片镜检则是用于结核病诊断的重要检测之一。AFB(Acid Fast Bacteria Stain，抗酸染色)涂片显微镜虽然快速且便宜，但由于假阳性原因(例如样品中存在NTM)而使其敏感性不高；培养方法则需要2
‑
6周才能产生结核病的诊断结果。与结核病不同，用于诊断NTM疾病、区分MTBC和NTM 以及区分NTM物种的方法是复杂且不发达的。
[0004]NTM病与TB病具有相似的临床表现，临床上快速鉴别MTBC和NTM的具体种属存在一定的困难。因此开发一种快速检测且能够有效鉴别MTBC和NTM快速生长型和缓慢生长型的检测产品和检测方法对疾病早期诊断和及时治疗具有极为重要的意义。1998年，随着MTB标准菌株H37Rv全基因组序列的破译，人们对结核菌的研究从表型深入到基因水平，MTB对一线药物的分子耐药机制成为国内外研究的热点，研究者发现MTB耐药性的产生主要与相关基因发生突变有关。一线药物中，利福平(RIF)耐药机制阐释的较为完全，研究发现约95％的RIF耐药性产生与MTB 编码RNA聚合酶β亚基基因(即rpoB基因)特定区域发生突变有关。
[0005]目前结核菌常用的诊断方法有括结核菌素试验、细胞免疫介导的结核菌γ干扰素释放试验、标本直接涂片或集菌后涂片检测、病原菌分离培养、基因芯片法、反向杂交法、DNA测序法等，但存在操作步骤繁杂、对人员技术水平要求较高，设备昂贵，无法检测所有突变区域等缺点。因此，本领域亟需开发一种操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、可用于结核分枝杆菌的检测以及耐药位点的检测，则可大幅度提高检测效率，帮助临床及早确定治疗方案。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的试剂盒、检测方法及其应用。为了满足对具有更广泛识别范围的简单快速分子检测的需求，可以简单快速识别临床中常见的致病性分枝杆菌，以及是否含有利福平的耐药位点，进而为临床诊断和治疗提供帮助。
[0007]本专利技术的第一个方面，提供了一种检测非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的多重荧光PCR引物组，所述非结核分枝杆菌包括缓慢生长型(包括鸟分枝杆菌复合群和堪萨斯分枝杆菌)和快速生长型(包括脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌)。
[0008]本专利技术的第一个方面，提供了一种鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的组合物，包括引物组和探针组，所述引物组包括：
[0009]NTM引物：
[0010]NTM
‑
F：5
’‑
GGAAGTYGCCAAGAAGACYGAC
‑3’
[0011]NTM
‑
R：5
’‑
CTTSAGACCCAKCGGGTT
‑3’
[0012]MTBC引物：
[0013]MTBC
‑
F：5
’‑
CAGGACCACGATCGCTGA
‑3’
[0014]MTBC
‑
R：5
’‑
TAGGTGCTGGTGGTCCGA
‑3[0015]人源基因引物：
[0016]IC
‑
F：5
’‑
CGGAGGGAAGCTCATCAG
‑3’
[0017]IC
‑
R：5
’‑
CCCTAGTCTCAGACCTTCCCA
‑3’
；
[0018]rpoB基因引物：
[0019]rpoB
‑
F:CAGACGTTGATCAACATCCG
[0020]rpoB
‑
R：TACGGCGTTTCGATGAAC
[0021]所述探针组包括：
[0022]龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌群：
[0023]NTM
‑
fast
‑
P：5
’‑
CRGCGACGTTACGCAGACCTTCC
‑3’
[0024]鸟分枝杆菌复合群：
[0025]NTM
‑
slow
‑
P1：5
’‑
CCGTGGCCGTCGTCGTGC
‑3’
[0026]堪萨斯分枝杆菌：
[0027]NTM
‑
slow
‑
P2：5
’‑
CYGGCGACGGCACCACCACG
‑3’
[0028]结核分枝杆菌复合群：
[0029]MTBC
‑
P：5
’‑
CACAGCCCGTCCCGCCGA
‑3’
[0030]人源基因：
[0031]IC
‑
P探针：5
’‑
CCACGAGCTGAGTGCGTCCTGTC
‑
3；
[0032]rpoB基因内参的引物和探针：
[0033]rpoB
‑
F:CAGACGTTGATCAACATCCG
[0034]rpoB
‑
R：TACGGCGTTTCGATGAAC
[0035]其中以靶向rpoB的引物为通用引物，分别设计利福平耐药决定区的516位点的探针、526位点的探针、531位点的探针，分别采用不同荧光修饰。其中下划线位置为锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)，增强探针特异性。
[0036]其中，516位点存在2种突变型，分别为GTC、TAC，526位点存在4种突变型，分别为TAC、GAC、CGC、TGC，531位点存在2种突变型，分别为TGG、TTG。
[0037]靶向所述516位点探针的核酸序列为：
[0038]rpoB
‑
P1
‑
516：TGGACCAGAACAACC...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别非结核、结核分枝杆菌及其利福平耐药性的组合物，包括引物组和探针组，所述引物组包括：NTM引物：NTM
‑
F：5
’‑
GGAAGTYGCCAAGAAGACYGAC
‑3’
NTM
‑
R：5
’‑
CTTSAGACCCAKCGGGTT
‑3’
MTBC引物：MTBC
‑
F：5
’‑
CAGGACCACGATCGCTGA
‑3’
MTBC
‑
R：5
’‑
TAGGTGCTGGTGGTCCGA
‑
3人源基因引物：IC
‑
F：5
’‑
CGGAGGGAAGCTCATCAG
‑3’
IC
‑
R：5
’‑
CCCTAGTCTCAGACCTTCCCA
‑3’
；所述探针组包括：NTM
‑
fast
‑
P：5
’‑
CRGCGACGTTACGCAGACCTTCC
‑3’
NTM
‑
slow
‑
P1：5
’‑
CCGTGGCCGTCGTCGTGC
‑3’
NTM
‑
slow
‑
P2：5
’‑
CYGGCGACGGCACCACCACG
‑3’
MTBC
‑
P：5
’‑
CACAGCCCGTCCCGCCGA
‑3’
IC
‑
P探针：5
’‑
CCACGAGCTGAGTGCGTCCTGTC
‑
3；还包括rpoB基因内参的引物：rpoB
‑
F:CAGACGTTGATCAACATCCGrpoB
‑
R：TACGGCGTTTCGATGAAC还包括rpoB基因探针：rpoB
‑
P1
‑
516：TGGACCAGAACAACCrpoB
‑
P2
‑
526：ACCCACAAGCGCCrpoB
‑
P3
‑
531：CCAGCGCCGACAG其中N代表碱基A/T/C/G，Y代表碱基C/T，S代表碱基G/C，K代表碱基G/T，R代表碱基A/G；其中探针组中每条探针的序列两端标记有荧光基团和淬灭基团，且IC
‑
P探针、MTBC
...

【专利技术属性】
技术研发人员：易康，朱祥羽，顾立江，樊晓梅，
申请(专利权)人：南京诺因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：