一种昆虫样本除色剂以及一种昆虫RNA提取方法技术

本发明专利技术提供了一种昆虫样本除色剂以及一种昆虫RNA提取方法，属于昆虫样本处理技术领域。本发明专利技术意外发现苯酚、氯仿、异戊醇和聚乙烯吡咯烷酮以特定比例组成的除色剂对昆虫样本能够产生显著的除色效果，能够克服现有技术中昆虫样本除色效果差的问题，可以用于昆虫核酸提取。经实验验证本发明专利技术的除色剂不会影响后续实验，所得核酸样品质量较高。所得核酸样品质量较高。所得核酸样品质量较高。

【技术实现步骤摘要】
一种昆虫样本除色剂以及一种昆虫RNA提取方法


[0001]本专利技术涉及昆虫样本处理
，尤其涉及一种昆虫样本除色剂以及一种昆虫RNA提取方法。

技术介绍

[0002]核酸提取是分子生物学试验的基础，高质量的核酸是进行分子标记、基因克隆及基因表达研究等下游技术的必要前提。目前用于昆虫DNA提取的方法主要有SDS法、CTAB法等，用于昆虫RNA提取的方法主要有异硫氰酸胍法、TRIzol法等，这些方法使用过程中常存在干扰核酸完整性、纯度和浓度的酶和色素等物质，直接或间接地影响核酸的提取质量。
[0003]现有技术一般采用氯仿作为除色剂，通过增加氯仿抽提除色次数来提升脱色效果(参见董小林.昆虫总RNA提取及实时荧光定量PCR方法探讨[J].应用昆虫学报，2013，50(5):5.)，但是专利技术人在研究中发现，此方法对于色素含量较高、不易除去的昆虫种类来说并不可行，因此，现有技术中的昆虫样本除色剂除色效果仍需改进。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种昆虫样本除色剂以及一种昆虫RNA提取方法，以解决现有技术中昆虫样本除色效果差的问题。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种昆虫样本除色剂，包含如下重量份数的组分：
[0007]苯酚75～150份、氯仿20～30份、异戊醇0.5～1.5份、聚乙烯吡咯烷酮0.2～2份。
[0008]本专利技术还提供了上述昆虫样本除色剂的制备方法，包含如下步骤：先将苯酚、氯仿和异戊醇混合，得到混合溶液；
[0009]将聚乙烯吡咯烷酮溶于所述混合溶液，得到昆虫样本除色剂。
[0010]本专利技术还提供了上述昆虫样本除色剂在昆虫核酸提取过程中的应用。
[0011]本专利技术还提供了一种昆虫RNA提取方法，包括如下步骤：
[0012]S1：将昆虫样本与TRIzol提取液混合，静置后进行第一次离心，得到第一上清和第一沉淀；
[0013]S2：将所述第一上清与上述昆虫样本除色剂混合，静置后进行第二次离心，得到第二上清和第一下层有机溶液；
[0014]S3：将所述第二上清与上述昆虫样本除色剂混合，静置后进行第三次离心，得到第三上清和第二下层有机溶液；
[0015]S4：将所述第三上清与氯仿混合，静置后进行第四次离心，得到第四上清和第三下层有机溶液；
[0016]S5：将所述第四上清与异丙醇混合，静置后进行第五次离心，得到第五上清和第二沉淀；
[0017]S6：采用乙醇水溶液将所述第二沉淀进行洗涤，然后进行第六次离心，得到第六上
清和第三沉淀；
[0018]所述第三沉淀即为昆虫RNA。
[0019]优选的，所述昆虫样本与TRIzol提取液的质量体积比为1mg:3～8μl；
[0020]所述S2中第一上清与昆虫样本除色剂的体积比为1:0.8～1.2；
[0021]所述S3中第二上清与昆虫样本除色剂的体积比为1:0.8～1.2；
[0022]所述第三上清与氯仿的体积比为1:0.8～1.2；
[0023]所述第四上清与异丙醇的体积比为1:0.8～1.2；
[0024]所述第二沉淀与乙醇水溶液的质量体积比为1mg:3～8μl。
[0025]优选的，所述第一次离心的转速为10000～14000r/min，时间为8～12min；
[0026]所述第二次离心的转速为10000～14000r/min，时间为4～6min；
[0027]所述第三次离心的转速为10000～14000r/min，时间为4～6min；
[0028]所述第四次离心的转速为10000～14000r/min，时间为4～6min；
[0029]所述第五次离心的转速为10000～14000r/min，时间为4～6min；
[0030]所述第六次离心的转速为5500～8000r/min，时间为4～6min。
[0031]优选的，所述乙醇水溶液的体积浓度为70～80％。
[0032]优选的，所述第一次离心、第二次离心、第三次离心、第四次离心、第五次离心和第六次离心的温度独立地为3～5℃。
[0033]本专利技术的技术效果和优点：
[0034]本专利技术意外发现苯酚、氯仿、异戊醇和聚乙烯吡咯烷酮以特定比例组成的除色剂对昆虫样本能够产生显著的除色效果，可以用于昆虫核酸提取中。经实验验证本专利技术的除色剂不会影响后续实验，所得核酸样品质量较高。
附图说明
[0035]图1为加入TRIzol后离心获得的上清液；
[0036]图2为加入氯仿后离心获得的上清液；
[0037]图3为实施例4获得的RNA溶解液样品；
[0038]图4为对比例3中加入TRIzol后离心获得的上清液；
[0039]图5为加入氯仿洗涤1次后获得的上清液；
[0040]图6为加入氯仿洗涤2次后获得的上清液；
[0041]图7为加入氯仿洗涤3次后获得的上清液；
[0042]图8为加入氯仿洗涤4次后获得的上清液；
[0043]图9为RNA完整性电泳图；
[0044]图10为反转录后cDNA质量检测电泳图；
[0045]图11为异色瓢虫样品加入TRIzol后离心获得的上清液；
[0046]图12为提取的RNA溶液对比图；
[0047]图13为异色瓢虫电泳检测结果图；
[0048]图14为异色瓢虫RNA完整性检测结果。
具体实施方式
[0049]本专利技术提供了一种昆虫样本除色剂，包含如下重量份数的组分：
[0050]苯酚75～150份、氯仿20～30份、异戊醇0.5～1.5份、聚乙烯吡咯烷酮0.2～2份。
[0051]在本专利技术中，所述昆虫样本除色剂包括苯酚75～150份，所述苯酚的重量份数优选为80～140份，进一步优选为100～120份；所述昆虫样本除色剂包括氯仿20～30份，所述氯仿的重量份数优选为23～27份；所述昆虫样本除色剂包括异戊醇0.5～1.5份，所述异戊醇的重量份数优选为0.8～1.2份；所述昆虫样本除色剂包括聚乙烯吡咯烷酮0.2～2份，所述聚乙烯吡咯烷酮的重量份数优选为0.5～1.5份。
[0052]本专利技术还提供了上述昆虫样本除色剂的制备方法，包含如下步骤：先将苯酚、氯仿和异戊醇混合，得到混合溶液；将聚乙烯吡咯烷酮溶于混合溶液中，得到昆虫样本除色剂；在本专利技术中，所述昆虫样本除色剂中的聚乙烯吡咯烷酮优选为完全溶解的状态。
[0053]本专利技术还提供了上述昆虫样本除色剂在昆虫核酸提取过程中的应用，所述昆虫样本除色剂优选作为唯一的除色剂应用于提取过程，也可以与其他试剂结合使用。
[0054]本专利技术还提供了一种昆虫RNA提取方法，包括如下步骤：
[0055]S1：将昆虫样本与TRIzol提取液混合，静置后进行第一次离心，得到第一上清和第一沉淀；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种昆虫样本除色剂，其特征在于，包含如下重量份数的组分：苯酚75～150份、氯仿20～30份、异戊醇0.5～1.5份、聚乙烯吡咯烷酮0.2～2份。2.权利要求1所述的昆虫样本除色剂的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：先将苯酚、氯仿和异戊醇混合，得到混合溶液；将聚乙烯吡咯烷酮溶于所述混合溶液，得到昆虫样本除色剂。3.权利要求1所述的昆虫样本除色剂在昆虫核酸提取过程中的应用。4.一种昆虫RNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将昆虫样本与TRIzol提取液混合，静置后进行第一次离心，得到第一上清和第一沉淀；S2：将所述第一上清与权利要求1所述的昆虫样本除色剂混合，静置后进行第二次离心，得到第二上清和第一下层有机溶液；S3：将所述第二上清与权利要求1所述的昆虫样本除色剂混合，静置后进行第三次离心，得到第三上清和第二下层有机溶液；S4：将所述第三上清与氯仿混合，静置后进行第四次离心，得到第四上清和第三下层有机溶液；S5：将所述第四上清与异丙醇混合，静置后进行第五次离心，得到第五上清和第二沉淀；S6：采用乙醇水溶液将所述第二沉淀进行洗涤，然后进行第六次离心，得到第六上清和第三沉淀；所述第三沉淀即为昆虫RNA。5.根据权利要求4所述的昆虫RNA提取方法，其特征在于，所述昆虫样本与TRI...

【专利技术属性】
技术研发人员：李萌萌，朱芬，石志辉，万雨佳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：