大规模平行测序中的恢复阶段制造技术

确定核酸的序列通常需要根据序列中一个或多个核苷酸的身份进行产生信号的反应的多个循环。测序通常在模板的多个拷贝上进行，以增强信号并提高精确度。然而，随着循环数的增加，一些拷贝发生异相，增加了信噪比并损害了精确度。本发明专利技术提供了一种利用封闭基团和二核苷酸识别使每个拷贝同相的策略。这提高了精确度，并使用户能够增加序列读数的长度。并使用户能够增加序列读数的长度。并使用户能够增加序列读数的长度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】大规模平行测序中的恢复阶段
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求于2020年3月18日申请的美国临时专利申请62/991，440的优先权。这些申请的全部内容都通过引用并入本文用于所有目的。


[0002]本公开中的技术一般涉及确定靶多核苷酸的核酸序列，例如基因组DNA。

技术介绍

[0003]对用于核酸测序和再测序的低成本、高通量方法的需求导致开发出“大规模平行测序”(MPS)技术。
[0004]一种常用的用于DNA测序的方法被称为“合成测序”(SBS)，如Ronaghi等人,Science,281:363
‑
365,1998；Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:414
‑
419,2003；Metzker,Nat Rev Genet.11:31
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46,2010；Ju等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:19635
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19640,2006；Bentley et al.,Nature456:53
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59,2008；以及在美国专利No 6,210,891，No 6,828,100，No6,833,246和No 6,911,345以及No 10,190,162中所公开的。SBS通常需要通过与被测序的模板相反的正确互补核苷酸的受控掺入而延伸与单链模板多核苷酸杂交的引物。所得产物有时被称作“延伸引物”或“生长链”。在一种方法中，可逆终止子核苷酸(RT)用于确定DNA模板的序列。在最常用的SBS方法中，每个RT包括修饰的核苷酸，该修饰的核苷酸包括：(1)封闭基团，所述封闭基团确保通过DNA聚合酶仅将单个碱基添加到生长DNA拷贝链的3
″
端，和(2)荧光标记。在美国专利No.10,851,410和Drmanac,S.et al.,bioRxiv 2020.02.19.953307中描述了一种替代方法，称为测序，其中使用未标记的可逆终止子核苷酸，两者通过引用并入本文。

技术实现思路

[0005]在一些大规模平行测序(MPS)方法中，确定核酸的序列通常需要(i)制备不同模板序列的文库，(ii)将每个模板序列的许多拷贝(“克隆群体”)固定在底物上的不同位点，和(iii)进行测序反应的多个循环。底物上的不同位点可以位于随机的、间隔开的位置，或者这些位点可以排列成有序阵列。所述测序反应在所述阵列上的每个位置处产生信号。该信号是通过一种方法产生的，该方法包括将核苷酸掺入模板的每个拷贝中。在每个位点(而不是单个模板分子)测序克隆群体导致较强的信号，提高精确度，并且在一些方法中，减少了在产生克隆群体的过程中出现的扩增误差。
[0006]然而，这些优点要求在每个循环中在相中发生的每个位置处互补核苷酸的掺入。也就是说，在其中掺入核苷酸的每个循环中，掺入发生在阵列上那个位置的大多数或几乎所有模板拷贝中。然而，在每个循环中，对于在该位点的克隆群体的一定数量的模板，有可能发生未掺入或误掺入。未掺入或误掺入的模板可能在该位点与其它模板异相。随着循环数量的增加，异相模板在每个位点累积，增加了信噪比，降低了精确度，并限制了这些位点
的读取长度。本公开描述了用于减少异相模板数量的重新定相策略，从而导致精度和读取长度的改进。
[0007]模板序列的克隆群体的例子包括(为了说明而非限制)DNA纳米球(具有模板序列的许多拷贝以及包括引物结合位点的接头序列的单链多联体)，包括DNB的原位扩增产物)、双链DNA多联体、通过桥接扩增或其它扩增方法产生的扩增子克隆簇。
[0008]总的来说，本公开提供了一种在核酸双链体的克隆群体中重新定相延伸引物的方法，核酸双链体的克隆群体包括与模板序列杂交的延长引物，其中克隆群体中的多个延伸引物具有不同的3'端，因此是异相的。这可以通过以下步骤实现：(1)通过使用聚合酶掺入与模板序列互补的一个或多个核苷酸和包含核苷酸三磷酸酯A，T，C和G的核苷酸或其类似物延伸延伸引物，其中所述核苷酸中的一种是被第一封闭基团封闭的可逆终止子，而其它三种核苷酸不被封闭，直到基本上所有延伸引物被封闭；然后(2)使延伸引物解除封闭。
[0009]该一般方法包括二核苷酸频率重新定相(DFR)技术。每个延伸引物延伸直到达到选定的二核苷酸，其中所述选定的二核苷酸具有式XY。二核苷酸(X)的第一核苷酸可以是被第一封闭基团封闭的可逆终止子，Y是二核苷酸的第二核苷酸。第二核苷酸(Y)可以是被第二封闭基团封闭的可逆终止子，或含有Y的封闭变性寡核苷酸，例如，在5
’
端。
[0010]在一般DFR方法中包括将核酸双链体的克隆群体中的延伸引物重新定相至选定的二核苷酸(XY)的方法，其中所述双链体各自包含与模板序列退火的延伸引物。当克隆群体中的延伸引物具有不同的3
’
端并因此异相时，该方法是有益的。重新定相方法是通过执行以下的多个循环来完成的：(i)使用包含聚合酶和选自A，T，C，和G的四个核苷酸三磷酸酯和/或其类似物的第一混合物延伸所述延伸引物，其中第一混合物中的核苷酸三磷酸酯或类似物之一对应于所选二核苷酸的第一核苷酸(X)并被第一封闭基团封闭，并且其中第一混合物中的其它三个核苷酸三磷酸酯或类似物未封闭，延伸继续进行，直到基本上所有延伸引物被第一封闭基团封闭。
[0011]随后的步骤包括(ii)使第一封闭基团解除封闭；和(iii)用包含聚合酶和对应于所选二核苷酸的第二核苷酸(Y)并被第二封闭基团封闭的选自A，T，C，和G的单核苷酸三磷酸酯及其类似物的第二混合物处理来自(ii)的延伸引物。第二混合物任选地包括不对应于被第一封闭基团封闭的第二核苷酸(Y)的三个核苷酸三磷酸酯或类似物(或者，在一些实施方案中，被不包括第二封闭基团的多个第一封闭基团封闭)，例如，T*C**G***其中是第二封闭基团，*,**,和***是第一封闭基团，在与解除封闭的封闭基团
‑
1相同的条件第二封闭基团未被解除封闭。重复所述多个循环，直到基本上所有的延伸引物被第二封闭基团封闭。然后第二封闭基团被解除封闭，从而使克隆群体中的延伸引物重新定相。
[0012]在一种这样的方法中，第二混合物中仅有的三磷酸核苷酸是被第二封闭基团封闭的三磷酸核苷酸或类似物。或者，第二混合物包含被第二基团封闭的核苷酸三磷酸酯或类似物，并且还包含不对应于被第一封闭基团封闭的第二核苷酸(Y)的三核苷酸三磷酸酯或类似物。第一和第二封闭基团中的任一者可以是O
‑
叠氮甲基，并且第一和第二封闭基团中的另一者可以是O
‑
NH2基团。
[0013]DFR的一般方法的另一种变体使用寡核苷酸来识别第二核苷酸。这是通过执行以下步骤的多个循环来完成的：(i)使用包含聚合酶和选自A，T，C，和G的四个核苷酸三磷酸酯和/或其类似物的第一混合物延伸延伸引物，其中第一混合物中的核苷酸三磷酸酯或类似
物之一对应于所选二核苷酸的第一核苷酸(X)并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在核酸双链体的克隆群体中重新定相延伸引物的方法，该核酸双链体的克隆群体包含与模板序列杂交的延伸引物，其中所述克隆群体中的多个所述延伸引物具有不同的3'末端并因此异相，所述方法包括：(1)通过使用聚合酶和包含核苷酸三磷酸A、T、C和G的核苷酸或其类似物掺入与所述模板序列互补的一个或多个核苷酸来延伸所述延伸引物，其中所述核苷酸之一是用第一封闭基团封闭的可逆终止子，其他三个核苷酸不封闭，直到基本上所有延伸引物都被封闭；接着(2)使所述延伸引物解除封闭。2.根据权利要求1所述的方法，其包括二核苷酸频率重新定相(DFR)，其中每个延伸引物被延伸直至到达选定的二核苷酸，其中所述选定的二核苷酸具有式XY，其中X是所述二核苷酸的第一核苷酸并且是用所述第一封闭基团封闭的可逆终止子，并且Y是所述二核苷酸的第二核苷酸。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二核苷酸Y是被第二封闭基团封闭的可逆终止子。4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第二核苷酸是含有Y的封闭寡核苷酸。5.一种将核酸双链体的克隆群体中的延伸引物重新定相至选定的二核苷酸(XY)的方法，其中所述双链体各自包含与模板序列退火的延伸引物，其中所述克隆群体中的所述多个延伸引物具有不同的3
’
端并且因此是异相的，其中所述方法包括：(a)执行以下多个循环：(i)使用包含聚合酶和选自A、T、C和G的四个核苷酸三磷酸和/或其类似物的第一混合物延伸所述延伸引物，其中所述第一混合物中的核苷酸三磷酸或类似物之一对应于所述选定的二核苷酸的第一核苷酸(X)并被第一封闭基团封闭，并且其中所述第一混合物中的其他三个核苷酸三磷酸或类似物未被封闭，继续所述延伸直到基本上所有所述延伸引物都被所述第一封闭基团封闭；然后(ii)使所述第一封闭基团解除封闭；以及(iii)用第二混合物处理来自(ii)的所述延伸引物，所述第二混合物含有聚合酶和对应于所述选定的二核苷酸的第二核苷酸(Y)并且被第二封闭基团封闭的选自A、T、C或G的单核苷酸三磷酸及其类似物，其中所述第二混合物任选地包括不对应于被所述第一封闭基团封闭的所述第二核苷酸(Y)的三个核苷酸三磷酸或类似物，(b)重复步骤(a)直到基本上所有所述延伸引物都被所述第二封闭基团封闭；以及(c)使所述第二封闭基团解除封闭；从而重新定相所述克隆群体中的所述延伸引物。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二混合物中仅有的三磷酸核苷酸是被所述第二封闭基团封闭的核苷酸三磷酸或类似物。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二混合物含有被所述第二基团封闭的所述三磷酸核苷酸或类似物，以及不对应于被所述第一封闭基团封闭的所述第二核苷酸(Y)的所述三个核苷酸三磷酸或类似物。8.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述第一封闭基团和第二封闭基团中的任一个是O叠氮甲基，并且所述第一封闭基团和第二封闭基团中的另一个是O
‑
NH2基团。
9.一种将核酸双链体的克隆群体中的延伸引物重新定相至选定的二核苷酸(XY)的方法，其中所述双链体各自包含与模板序列退火的延伸引物，其中所述克隆群体中的多个所述延伸引物具有不同的3
’
端并且因此是异相的，其中所述方法包括：(a)执行以下多个循环：(i)使用包含聚合酶和选自A、T、C和G的四个核苷酸三磷酸和/或其类似物的第一混合物延伸所述延伸引物，其中所述第一混合物中的核苷酸三磷酸或类似物中的一种对应于所述选定的二核苷酸的所述第一核苷酸(X)并被第一封闭基团封闭，并且其中所述第一混合物中的其他三个核苷酸三磷酸或类似物未被封闭，继续所述延伸直到基本上所有所述延伸引物都被所述第一封闭基团封闭；然后(ii)使所述第一封闭基团解除封闭；以及(iii)用包含连接酶和在3'末端封闭的5'磷酸化寡核苷酸的第二混合物处理所述延伸引物，其中所述寡核苷酸中的碱基对应于所选定的所述二核苷酸的所述第二核苷酸(Y)；(b)重复步骤(a)直到基本上所有所述延伸引物都被所述寡核苷酸封闭；以及(c)使所述寡核苷酸解除封闭；从而重新定相所述克隆群体中的所述延伸引物。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述5'磷酸化寡核苷酸具有式U(N)
Z
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X，其中U是尿嘧啶，X是封闭结构，Z是6
‑
20，并且(N)
Z
是简并寡核苷酸序列，并且其中步骤(c)中的所述解除封闭包括从所述延伸引物中去除所述寡核苷酸。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述不可逆的封闭结构在所述寡核苷酸的3'端掺入反向dT(IDT)，从而产生抑制通过3'外切核酸酶进行的降解和通过DNA聚合酶进行的延伸的3'
‑
3'键。12.根据权利要求10或11所述的方法，其中通过用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1(Ape1)的酶混合物处理以切割并去除所述尿嘧啶碱基来去除5'磷酸化寡核苷酸。13.根据权利要求5至12中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中进行五至十五个循环。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中在所述重新定相之前从每个引物的所述3'端去除5至50个碱基，从而将所述延伸引物的所述3'端重新调整到上游位置。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述重新调整包括：(i)在所述重新定相之前进行的合成测序期间，其包括在所述测序的至少一些循环中的三磷酸尿嘧啶或其类似物，其能掺入所述延伸引物中代替三磷酸胸腺嘧啶；然后(ii)在掺入的尿嘧啶碱基处切割所述延伸引物。16.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(ii)中的所述切割是使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1(Ape1)的酶混合物进行的。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述重新调整包括：(i)在所述重新定相之前进行的合成测序期间，包括在所述测序的至少一些循环中包含核糖核苷酸(RNA)或5'α
‑
磷酸硫代修饰核苷酸的核苷酸三磷酸；然后(ii)在掺入的RNA碱基或掺入的5'α
‑
磷酸硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：马修，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：