WNT超级激动剂制造技术

本发明专利技术提供了多特异性多价抗原结合分子，其能够通过结合并激活至少一种或两种WNT受体和WNT增强剂而用作WNT激动剂、WNT增强剂和WNT超级激动剂分子。超级激动剂分子。超级激动剂分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】WNT超级激动剂
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年2月24日递交的美国临时申请第62/980,870号和2020年11月16日递交的美国临时申请第63/114,368号的优先权，其中每项通过引用整体并入本文中。关于序列表的申明
[0002]与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且在此通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称是SRZN_018_02WO_ST25.txt。该文本文件大小为1,179KB，创建于2021年2月24日，并正在通过EFS
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Web以电子方式提交。
专利

[0003]本专利技术提供了既具有WNT激动剂活性又具有WNT增强剂活性或仅具有WNT激动剂或WNT增强剂活性的抗原结合形式。专利技术背景
[0004]WNT(“Wingless相关整合位点”或“Wingless和Int
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1”或“Wingless
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Int”)配体及其信号在控制许多重要器官和组织(包括骨骼、肝脏、皮肤、胃、肠、肾、中枢神经系统、乳腺、味蕾、卵巢、耳蜗和许多其他组织)的发育、体内平衡和再生中起关键作用(例如，由Clevers、Loh和Nusse(2014)Science；346:54综述的)。WNT信号传导通路的调节具有治疗退行性疾病和组织损伤的潜力。
[0005]七次跨膜受体Frizzled(FZD)对几乎所有WNT信号传导都至关重要，并且N
‑
末端FZD富含半胱氨酸结构域(CRD)用作WNT结合结构域。除了FZD，WNT/β
‑
连环蛋白通路还需要低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(LRP5/6)以作为共受体。LRP5和LRP6是功能冗余的单通道跨膜受体。LRP6的生物化学研究表明，不同的WNT可能与LRP5/6蛋白的不同胞外结构域结合。LRP6的细胞外结构域包含四个重复序列的β
‑
螺旋桨和表皮生长因子样(βP
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E)结构域。细胞外LRP6区的晶体结构表明βP
‑
E重复代表两个离散的、紧凑的、刚性结构，每个结构包含两个βP
‑
E对。WNT9b结合LRP6的细胞外结构域的前两个βP
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E重复序列，而WNT3a结合最后两个βP
‑
E结构域。
[0006]非WNT激动剂或增强剂分别包括Norrin和R
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脊椎蛋白(R
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Spondin，RSPO)。Norrin是一种Fz4特异性配体，其与另一种WNT受体LRP5的结合和激活一起形成WNT替代分子或模拟分子。
[0007]四个RSPO基因代表可以增强WNT通路信号传导的保守分泌蛋白家族。LGR4/5/6(富含亮氨酸重复的GPCR 4、5和6)是RSPO的受体。
[0008]RSPO的作用似乎是稳定WNT受体、FZD和LRP5/6，以促进或增强WNT信号传导。RSPO 1
‑
4是放大WNT信号的配体家族。每个RSPO都通过受体复合物起作用，所述受体复合物的一端含有锌和环指3(ZNRF3)或环指蛋白43(RNF43)，并且另一端含有富含亮氨酸重复的G
‑
蛋白偶联受体4
‑
6(例如，由Knight和Hankenson 2014,Matrix Biology；37:157
‑
161综述的)。RSPO也可能通过另外的作用机制发挥作用(Lebensohn和Rohatgi 2018,eLife,7:e33126)。ZNRF3和RNF43是两种膜结合的E3连接酶，其特异性靶向WNT受体(FZD1
‑
10和LRP5或LRP6)以
进行降解。RSPO与ZNRF3/RNF43和LGR4
‑
6的结合使得清除或隔离三元复合物，从而从WNT受体中去除E3连接酶并稳定WNT受体，使得增强WNT信号。每个RSPO包含两个Furin结构域(1和2)，Furin结构域1与ZNRF3/RNF43结合，且Furin结构域2与LGR4
‑
6结合。含有Furin结构域1和2的RSPO片段足以放大WNT信号传导。
[0009]抗体是一种成熟且快速增长的药物类别，目前在美国和/或欧洲销售用于成像或治疗的至少45种基于抗体的产品，全球总销售额为～1000亿美元。抗体疗法的这一重大临床和商业成功激发了人们对开发包括双特异性抗体在内的下一代抗体药物的极大兴趣。正如其名称所暗示的，双特异性抗体或多特异性抗体(统称为“MsAb”)与至少两种不同的抗原或同一抗原上的至少两种不同的表位结合，这在50多年前首次证明。如临床开发中>30种BsAb所证明的，针对多特异性工程化单特异性抗体开辟了许多新的潜在治疗应用。
[0010]双特异性或多特异性抗体是一类工程化的抗体和抗体样蛋白，与“常规”单特异性抗体相比，它们在单个构建体中结合了两种或更多种不同的特异性抗原结合元件。由于双特异性抗体通常并不是天然存在的，因此它们是使用诸如细胞融合或重组DNA技术的技术以化学或生物学方式构建的。用单个分子结合两个或更多个不同表位的能力提供了许多潜在优势。一种方法是使用一个臂的特异性作为单个分子、细胞标志物或生物体(如细菌和病毒)的靶向位点，而另一臂作为效应位点以用于募集效应细胞或将分子有效载荷(如药物、细胞因子或毒素)递送至靶标。可选地，双特异性抗体可被用于双重靶向，允许以比单特异性抗体高得多的特异性检测或结合靶细胞类型。
[0011]免疫球蛋白的模块化结构已被开发用于产生越来越多(>60种)的可替代MsAb形式(参见例如，Spiess等人(2015)Mol.Immunol.67:95
‑
106)。MsAb在此分为五个不同的结构组：(i)双特异性IgG(BsIgG)(ii)附接有其它抗原结合部分的IgG，(iii)MsAb片段，(iv)多特异性融合蛋白，和(v)MsAb缀合物。这些不同的MsAb形式中的每一种在每种抗原的结合效价、抗原结合位点的几何形状、药代动力学半衰期以及在一些情况下的效应功能方面都具有不同的特性。
[0012]对于代表绝大多数正在开发的MsAb分子的拮抗性MsAb抗体，抗原结合模块的几何形状不太重要。然而，对于激动性MsAb，这些分子需要忠实地模拟天然配体的活性，结合几何结构可能是至关重要的(参见例如，Shi等人(2018)J.Biol.Chem.293:5909
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5919)。WNT替代分子也是如此，需要它们来结合和激活两种空间上分离的WNT受体FZD和LRP。
[0013]可以与异源寡聚WNT/LRP受体复合物结合的WNT替代分子先前已被描述(参见例如，WO2019/126398、US 2020
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0308287 A1、USSN17/257,817和WO2020/010308)，如使用RSPO的WNT增强剂(参见例如，W本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.WNT超级激动剂分子，其包含：a)Frizzled(FZD)结合结构域；b)LRP5/6结合结构域；和c)E3连接酶结合结构域，其中所述超级激动剂分子激活细胞中经典的WNT信号传导通路。2.如权利要求1所述的超级激动剂分子，其中：a)所述FZD结合结构域结合一种或多种FZD受体；b)所述LRP5/6结合结构域结合LRP5和/或LRP6中的一种或多种；并且c)所述E3连接酶结合结构域结合ZNRF3和/或RNF43。3.如权利要求1或权利要求2所述的超级激动剂分子，其包含一种或多种多肽，其中至少一种多肽包含融合至LRP5/6结合结构域的FZD结合结构域，并且其中至少一种多肽包含融合至FZD结合结构域或LRP5/6结合结构域的E3连接酶结合结构域。4.如权利要求3所述的超级激动剂分子，其中融合结合结构域直接融合在一起和/或经由肽连接子融合。5.如权利要求4所述的超级激动剂分子，其中所述肽连接子的长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸。6.如权利要求5所述的超级激动剂分子，其中所述肽连接子的长度为约5个氨基酸至约15个氨基酸，任选地为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。7.如权利要求4
‑
6中任一项所述的超级激动剂分子，其中所述肽连接子包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的超级激动剂分子，其中所述结合结构域中的至少一种选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab
′
2片段、双链抗体和Fv片段。9.如权利要求1
‑
8中任一项所述的超级激动剂分子，其中所述结合结构域中的至少一种与Fc片段融合，任选地其中所述Fc片段来自IgG、IgM、IgA、IgD或IgE抗体同种型或α、δ、ε、γ或μ抗体重链。10.如权利要求9所述的超级激动剂分子，其具有表3或表4中所示的结构。11.如权利要求10所述的超级激动剂分子，其具有Fv
‑
IgG结构。12.如权利要求1
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10中任一项所述的超级激动剂，其中所述WNT增强剂包含选自以下的E3连接酶结合结构域：突变的R
‑
脊椎蛋白(RSPO)蛋白及抗体或其功能片段。13.如权利要求12所述的超级激动剂分子，其中与野生型RSPO相比，所述突变的RSPO蛋白具有与富含亮氨酸重复的G
‑
蛋白受体4
‑
6(LGR4
‑
6)的减少的结合。14.如权利要求12所述的超级激动剂分子，其中所述E3连接酶结合结构域结合锌和环指3(ZNRF3)和/或环指蛋白43(RNF43)。15.如权利要求14所述的超级激动剂分子，其中所述E3连接酶结合结构域选自：scFv、VHH/sdAb、Fab片段、Fab
′
2片段、双链抗体和Fv片段。16.如权利要求15所述的超级激动剂分子，其中所述E3连接酶结合结构域直接或经由连接子与Fv
‑
IgG的Fc片段的C
‑
末端融合，任选地其中所述连接子是长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸，或约5个氨基酸至约15个氨基酸，或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的肽连接子。
17.如权利要求15所述的超级激动剂分子，其中所述E3连接酶结合结构域直接或经由连接子与以下的C
‑
末端融合：a)FZD结合结构域的轻链或其片段；b)FZD结合结构域的重链或其片段；c)LRP5/6结合结构域的轻链或其片段；或b)LRP5/6结合结构域的重链或其片段，任选地其中所述连接子是长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸，或约5个氨基酸至约15个氨基酸，或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的肽连接子。18.如权利要求15所述的超级激动剂分子，其中结合E3泛素连接酶的结合结构域直接或经由连接子与以下的N
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末端融合：a)FZD结合结构域的轻链或其片段；b)FZD结合结构域的重链或其片段；c)LRP5/6结合结构域的轻链或其片段；或b)LRP5/6结合结构域的重链或其片段，任选地其中所述连接子是长度为约1个氨基酸至约30个氨基酸，或约5个氨基酸至约15个氨基酸，或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的肽连接子。19.如权利要求1
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18中任一项所述的超级激动剂分子，其包含与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％序列同一性的多肽，或每种多肽都与表3或表4中所提供的序列具有至少90％或95％的序列同一性的多肽的组合。20.药物组合物，其包含权利要求1
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19中任一项所述的WNT超级激动剂分子和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。21.治疗患有与减少的WNT信号传导相关的疾病或病症的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1
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19中任一项所述的WNT超级激动剂分子或权利要求20所述的药物组合物。22.如权利要求21所述的方法，其中所述疾病或病症选自：口腔粘膜炎、短肠综合征、炎性肠病(IBD)、其他胃肠道病症；代谢综合征的治疗、血脂异常、糖尿病的治疗、胰腺炎的治疗、其中外分泌或内分泌胰腺组织受损伤的病况；其中期望增强的表皮再生的病况，例如，表皮创伤愈合、糖尿病足溃疡的治疗、涉及牙、指甲或真皮发育不全等的综合征、其中血管生成是有益的病况；心肌梗塞、冠状动脉疾病、心力衰竭；免疫缺陷、移植物抗宿主病、急性肾损伤、慢性肾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、肝硬化、急性肝衰竭、具有丙型或乙型肝炎病毒感染或抗病毒药物治疗后的慢性肝病、酒精性肝病、酒精性肝炎、具有脂肪变性的非酒精性肝病或脂肪性肝炎，听力丧失的治疗，包括听觉毛细胞的内部和外部损失、前庭功能减退，黄斑变性，各种视网膜病的治疗，包括但不限于玻璃体视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、视网膜变性的其他疾病、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、干性AMD、Fuchs营养不良、其他角膜疾病，中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、多发性硬化和影响血脑屏障的其他病况；骨疾病、脊椎损伤、其他脊椎疾病和脱发症。23.生成、培养或维持器官、组织、细胞或类器官培养物的方法，其包括使所述器官、组织、细胞或类器官培养物与以下接触：a)权利要求1
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19中任一项所述的WNT超级激动剂分子；或
b)权利要求20所述的药物组合物。24.如权利要求23所述的方法，其用于离体维持所述器官或组织活力，包括：a)离体使获自供体的器官或组织与包含所述WNT超级激动剂分子或所述药物组合物的组合物接触，任选地通过灌注使获自供体的器官或组织与包含所述WNT超级激动剂分子或所述药物组合物的组合物接触；或b)在体内使供体器官或组织与包含所述WNT超级激动剂分子或所述药物组合物的组合物接触。25.如权利要求23所述的方法，其用于生成或维持所述类器官培养物，包括接触所述类器官培养物，任选地通过在包含所述WNT超级激动剂分子的培养基中培养所述类器官培养物。26.用于在对象中诱导骨形成或增加骨密度的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1
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19中任一项所述的WNT超级激动剂分子或权利要求20所述的药物组合物。27.如权利要求26所述的方法，其中所述WNT超级激动剂分子结合FZD5、FZD8和FZD9。28.用于再生对象的唾液腺或诱导对象的唾液腺生长的方法，其包括向所述对象施用有效量的权利要求1
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19中任一项所述的WNT超级激动剂分子或权利要求20所述的药物组合物。29.如权利要求28所述的方法，其用于治疗所述对象的唾液过少。30.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述WNT超级激动剂分子结合FZD1、FZ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳，
申请(专利权)人：瑟罗泽恩奥普瑞汀公司，
类型：发明
国别省市：