本发明专利技术涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用。本发明专利技术将骨髓间充质干细胞进行低氧处理(1％O2)，然后对骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的收集，并将其应用于促进成骨细胞增殖、迁移和成骨分化，以及利用细胞外囊泡与一种聚氨基酸温敏水凝胶复合用于治疗颅骨缺损。本发明专利技术中应用的低氧条件极大提高了骨髓间充质干细胞释放囊泡的能力，解决了细胞外囊泡在临床转化应用中产量低的难题。另外，低氧处理还优化了囊泡内容物的表达，有利于在骨缺损模型中发挥高效的修复作用。高效的修复作用。高效的修复作用。
【技术实现步骤摘要】
一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用
[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其是涉及一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用。
技术介绍
[0002]病理性骨吸收及缺损是临床上非常常见的一类病理现象，由于其吸收过程缓慢且无临床不适症状，通常不能及时引起人们的关注及干预。骨组织缺损在临床中主要通过移植骨进行修复，而移植骨的来源及免疫原性是治疗过程中医生和患者难以克服的障碍。研究人员尝试开发各种生物支架材料来满足临床移植骨的需求，将生物支架材料与干细胞共培养，评估其生物相容性，制备具有主动诱导作用的支架是当前热门的研究思路。然而，由于干细胞在体外生存条件严苛、不同来源干细胞免疫原性具有差异及干细胞在生物支架中存活率不稳定等因素，极大地限制了干细胞及生物支架材料在临床中的转化应用。
[0003]随着干细胞研究的进展和生物检测技术的进步，研究者们发现旁分泌机制在干细胞促进组织修复过程中发挥了重要作用，其中细胞外囊泡的作用受到极大关注。细胞外囊泡是一类由细胞主动释放的纳米级脂质双分子层囊泡，与细胞具有相似的生物学特性，在生理和病理环境中均可以分泌，通过运输蛋白质和多种RNA成分参与调控细胞内外平衡及细胞间通讯。已有大量研究表明，来源于间充质干细胞的细胞外囊泡能缓解心血管疾病的症状、修复缺损的软骨及皮肤损伤，作为一种安全性更高的非细胞药物，其治疗效果及安全性受到了肯定。骨组织修复需要动员骨髓内的间充质干细胞，而这些干细胞在体内长期处于生理性低氧环境中，与常规体外培养的常氧环境不一致，这些问题和限制因素都导致细胞层面和动物水平的研究成果无法实现临床转化。
[0004]目前，细胞外囊泡在实验室的研究及应用中均表现出卓越的修复效果。但是，其提取步骤复杂和产量低严重制约了其临床转化潜能，成为本领域研究人员亟待解决的难题。研究人员往往无法通过简单的处理同时提高细胞外囊泡的产量和质量。因此，开发一种实用的，能有效促进细胞外囊泡释放，同时不影响或者提高囊泡治疗质量的策略至关重要，有望加速细胞外囊泡临床应用转化的进程。
技术实现思路
[0005]为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用。本专利技术将骨髓间充质干细胞进行低氧处理(1％O2)，然后对骨髓间充质干细胞细胞外囊泡(也简称为“细胞外囊泡”)的收集，并将其应用于促进成骨细胞增殖、迁移和成骨分化，以及利用细胞外囊泡与一种聚氨基酸温敏水凝胶复合用于治疗颅骨缺损。本专利技术中应用的低氧条件极大提高了骨髓间充质干细胞释放囊泡的能力，解决了细胞外囊泡在临床转化应用中的产量低的难题。另外，低氧处理还优化了囊泡内容物的表达，有利于在骨缺损模型中发挥高效的修复作用。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取方法，包括以下步骤：
[0008](1)骨髓间充质干细胞的低氧处理：将骨髓间充质干细胞置于含胎牛血清的细胞培养基中进行培养，得到成熟的骨髓间充质干细胞，后处理后将成熟的骨髓间充质干细胞置于含无外泌体血清的细胞培养基，进行低氧培养；
[0009](2)骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液的获取：收集步骤(1)中低氧培养后的上清液，离心弃沉淀以去除残留的细胞和细胞碎片，得到骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液；
[0010](3)骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取：将步骤(2)得到的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液离心弃沉淀以去除杂质蛋白；进一步离心弃上清获得粗细胞外囊泡；将粗细胞外囊泡用PBS重悬，离心弃上清获得纯骨髓间充质干细胞细胞外囊泡。
[0011]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)中，所述骨髓间充质干细胞为扩增到P3～P5代的骨髓间充质干细胞。
[0012]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)中，含胎牛血清的细胞培养基为含10％胎牛血清的细胞培养基；
[0013]含无外泌体血清的细胞培养基为含2％无外泌体血清的细胞培养基。
[0014]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)中，低氧处理过程中置于体积分数为1％的O2培养箱中，培养温度为37℃，培养时间为48h。
[0015]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(3)中，将纯骨髓间充质干细胞细胞外囊泡用PBS重悬后于
‑
80℃下保存。
[0016]本专利技术的第二个目的是提供一种通过上述方法制备得到的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡。
[0017]本专利技术的第三个目的是提供一种负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0018]将骨髓间充质干细胞细胞外囊泡加入预冷的聚氨基酸温敏水凝胶中，混匀得到负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶。
[0019]在本专利技术的一个实施方式中，聚氨基酸温敏水凝胶与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为1mL：20μg。
[0020]本专利技术的第四个目的是提供一种通过上述方法制备得到的负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶。
[0021]本专利技术的第五个目的是提供一种负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶在制备治疗颅骨缺损药物中的应用。
[0022]在本专利技术的一个实施方式中，骨髓间充质干细胞细胞外囊泡促进颅骨成骨细胞增殖、迁移和成骨分化，包括以下步骤：
[0023](1)颅骨成骨细胞的增殖：将骨髓间充质干细胞细胞外囊泡加入培养的颅骨成骨细胞中，进行增殖培养；
[0024](2)颅骨成骨细胞的迁移：将培养后的颅骨成骨细胞接种于Transwell小室上层，下层加入骨髓间充质干细胞细胞外囊泡，进行迁移培养；
[0025](3)颅骨成骨细胞的成骨分化：将骨髓间充质干细胞细胞外囊泡加入培养的颅骨
成骨细胞中，进行成骨诱导。
[0026]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)中，培养后的颅骨成骨细胞与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为5
×
104个：2.5μg
‑
10μg；
[0027]步骤(2)中，培养后的颅骨成骨细胞与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为5
×
104个：2.5μg
‑
10μg；
[0028]步骤(3)中，培养后的颅骨成骨细胞与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为5
×
104个：2.5μg
‑
10μg。
[0029]在本专利技术的一个实施方式中，骨髓间充质干细胞细胞外囊泡在治疗颅骨缺损中的应用，包括以下步骤：
[0030](1)将预冷的聚氨基酸温敏水凝胶与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡混匀，得到混合物；
[0031](2)利用注射器将步骤(1)获得的混合物注射到大鼠颅骨缺损区以治疗颅骨缺损。
[0032]在本专利技术的一个实施方式中，所述聚氨基酸温敏水凝胶与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为1mL：20μg本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)骨髓间充质干细胞的低氧处理：将骨髓间充质干细胞置于含胎牛血清的细胞培养基中进行培养，得到成熟的骨髓间充质干细胞，后处理后将成熟的骨髓间充质干细胞置于含无外泌体血清的细胞培养基，进行低氧培养；(2)骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液的获取：收集步骤(1)中低氧培养后的上清液，离心弃沉淀以去除残留的细胞和细胞碎片，得到骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液；(3)骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取：将步骤(2)得到的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液离心弃沉淀以去除杂质蛋白；进一步离心弃上清获得粗细胞外囊泡；将粗细胞外囊泡用PBS重悬，离心弃上清获得纯骨髓间充质干细胞细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述骨髓间充质干细胞为扩增到P3～P5代的骨髓间充质干细胞。3.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取方法，其特征在于，步骤(1)中，含胎牛血清的细胞培养基为含10％胎牛血清的细胞培养基；含无外泌体血清的细胞培养基为含2％无外泌体血清的细胞培养基。4.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘月华，邓佳佳，於丽明，张维华，
申请(专利权)人：上海市口腔医院上海市口腔健康中心，
类型：发明
国别省市：
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