酱醪中微生物总DNA的提取方法技术

本发明专利技术涉及一种酱醪中微生物总DNA的提取方法：混合酱醪样品与吐温80水溶液，对所得混合物进行离心，收集酱醪沉淀；于液氮条件下，混合所述酱醪沉淀和经活化处理的阳离子交换树脂并研磨，收集粉料；混合所述粉料和溶菌酶缓冲液，孵育，制备孵育产物；混合所述孵育产物和DNA提取液进行DNA提取，对所得提取产物进行离心，收集上清液；混合所述上清液和乙醇进行DNA沉淀，对所得沉淀产物进行离心，收集DNA沉淀，清洗，获得微生物总DNA。采用本发明专利技术的DNA提取工艺，能够从盐分含量高、成分复杂的高盐稀态酱油发酵酱醪中提取出微生物总DNA，且微生物总DNA质量高，包括纯度高、完整性好，能够满足测序要求。本发明专利技术的提取方法，简单，安全，能迅速操作。速操作。速操作。

【技术实现步骤摘要】
酱醪中微生物总DNA的提取方法


[0001]本专利技术涉及生物学
，特别涉及一种酱醪中微生物总DNA的提取方法。

技术介绍

[0002]中国酱油酿造历史悠久，其中，高盐稀态工艺酿造酱油风味浓厚，味道鲜美，是未来酱油发展的主要方向。开放的制曲方式使得成曲和酱醪的微生物来源十分广泛，而微生物组成的不稳定性将会导致酱醪品质的波动，最终影响酱油产量与成品品质的稳定性。因此，明晰酱醪中微生物群落结构，对稳定和改善酱油品质、推进酱油酿造技术进步都显得尤为重要。
[0003]目前，对酱醪微生物的研究主要集中在通过可培养法对微生物组成进行研究分析。但传统的可培养法能培养的微生物种类十分有限，大部分的不可培养的微生物难以被发现，得到的微生物群不能准确地代表整个大曲的微生物群落组成。
[0004]应用分子生物学的方法，能有效地克服传统可培养技术的不足，通过扩增子测序能快速准确地得到酱醪微生物组成，在此基础上，利用宏基因组学还能进一步对群落中微生物的潜在功能进行预测。随着测序技术和组学技术的不断进步发展，人们对于酱醪中混菌发酵体系的研究有了必要的技术保障。无论哪种技术，都需要先从高盐稀态发酵酱醪中获得微生物总DNA，微生物总DNA的质量决定了最终结果的可靠性。
[0005]目前常用的DNA提取方法主要有化学法和试剂盒法，其中：化学法主要有CTAB法、SDS法，以及基于这些方法的改良方法，如专利技术专利CN104560955A；试剂盒法在样品处理和DNA提取阶段同样使用了化学法，区别主要在于其通常使用纯化柱吸附DNA后洗脱纯化，如专利CN107418952A。
[0006]然而，高盐稀态发酵酱醪中复杂的成分对微生物总DNA的提取造成一定的难度，采用目前常用的DNA提取方法无法从高盐稀态发酵酱醪中提取到高质量的微生物总DNA以满足基因测序的需求。
[0007]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术实施例的主要目的包括提供一种酱醪中微生物总DNA的提取方法，采用该提取方法，能够从高盐稀态酱油发酵酱醪中提取到高质量的微生物总DNA。
[0009]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0010]本专利技术实施例提供一种酱醪中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括如下步骤：
[0011]混合酱醪样品与吐温80水溶液，对所得混合物进行离心，收集酱醪沉淀；
[0012]于液氮条件下，混合所述酱醪沉淀和经活化处理的阳离子交换树脂并研磨，收集粉料；
[0013]混合所述粉料和溶菌酶缓冲液，孵育，制备孵育产物；
[0014]混合所述孵育产物和DNA提取液进行DNA提取，对所得提取产物进行离心，收集上清液；
[0015]混合所述上清液和乙醇进行DNA沉淀，对所得沉淀产物进行离心，收集DNA沉淀，清洗，获得微生物总DNA。
[0016]在本专利技术的一些实施例中，所述阳离子交换树脂为氢型阳离子交换树脂或者钠型阳离子交换树脂。
[0017]在本专利技术的一些实施例中，活化处理的步骤包括：将所述阳离子交换树脂置于活化剂中浸泡，去除活化剂。
[0018]在本专利技术的一些实施例中，活化处理的步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：
[0019](1)所述活化剂为氯化钠含量为5％
‑
15％(w/v)的氯化钠水溶液；
[0020](2)浸泡的条件包括：温度为15℃
‑
30℃，时间为0.5h
‑
1.5h；
[0021](3)去除活化剂的方法包括离心，离心的转速为8000rpm
‑
12000rpm，离心的时间为4min
‑
6min。
[0022]在本专利技术的一些实施例中，所述阳离子交换树脂的用量是所述酱醪样品质量的10wt％
‑
50wt％。
[0023]在本专利技术的一些实施例中，所述阳离子交换树脂的平均颗粒直径为4nm
‑
6nm。
[0024]在本专利技术的一些实施例中，所述吐温80水溶液中吐温80的含量为0.2％
‑
0.8％(w/v)。
[0025]在本专利技术的一些实施例中，每1g所述酱醪样品对应的所述吐温80水溶液的用量为1mL
‑
3mL。
[0026]在本专利技术的一些实施例中，离心所述混合物的条件包括：转速为10000rpm
‑
14000rpm，时间为10min
‑
20min。
[0027]在本专利技术的一些实施例中，孵育满足如下条件中的一个或者多个：
[0028](1)每3g所述粉料对应的所述溶菌酶缓冲液的用量为15mL
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25mL；
[0029](2)孵育的温度为60℃
‑
70℃，孵育的时间为25min
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35min。
[0030]在本专利技术的一些实施例中，离心所述提取产物的条件包括：转速为10000rpm
‑
14000rpm，时间为5min
‑
15min。
[0031]在本专利技术的一些实施例中，离心所述沉淀产物的条件包括：转速为10000rpm
‑
14000rpm，时间为5min
‑
15min。
[0032]在本专利技术的一些实施例中，清洗所述DNA沉淀采用的清洗剂为乙醇体积浓度为65％
‑
75％的乙醇水溶液。
[0033]在本专利技术的一些实施例中，所述酱醪样品的含盐量为15wt％
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25wt％。
[0034]在本专利技术的一些实施例中，所述酱醪样品为高盐稀态酱油发酵酱醪。
[0035]相对于传统技术，本专利技术具备如下有益效果：
[0036]本专利技术先采用吐温80水溶液对酱醪进行预处理，再于液氮条件下对预处理后的酱醪和经活化处理的阳离子交换树脂混合研磨，所得粉料经溶菌酶缓冲液孵育后经DNA提取液提取、乙醇沉淀、清洗，从而实现酱醪中微生物总DNA的提取。采用本专利技术的DNA提取工艺，能够从盐分含量高、成分复杂的高盐稀态酱油发酵酱醪中提取出微生物总DNA，且微生物总
DNA质量高(包括纯度高、完整性好)，能够满足测序要求。本专利技术的提取方法，简单，安全，能迅速操作。
附图说明
[0037]为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0038]图1为实施例1和对比例1所得高盐稀态发酵酱油的发酵晚期酱醪样品的微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图；图中，泳道1
‑
5为对比例1提取的5个酱醪平行样品总DNA，泳道6
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酱醪中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括如下步骤：混合酱醪样品与吐温80水溶液，对所得混合物进行离心，收集酱醪沉淀；于液氮条件下，混合所述酱醪沉淀和经活化处理的阳离子交换树脂并研磨，收集粉料；混合所述粉料和溶菌酶缓冲液，孵育，制备孵育产物；混合所述孵育产物和DNA提取液进行DNA提取，对所得提取产物进行离心，收集上清液；混合所述上清液和乙醇进行DNA沉淀，对所得沉淀产物进行离心，收集DNA沉淀，清洗，获得微生物总DNA。2.根据权利要求1所述的酱醪中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂满足如下条件中的一个或者多个：(1)所述阳离子交换树脂为氢型阳离子交换树脂或者钠型阳离子交换树脂；(2)活化处理的步骤包括：将所述阳离子交换树脂置于活化剂中浸泡，去除活化剂；(3)所述阳离子交换树脂的用量是所述酱醪样品质量的10wt％
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50wt％；和，(4)所述阳离子交换树脂的平均颗粒直径为4nm
‑
6nm。3.根据权利要求2所述的酱醪中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，活化处理的步骤具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)所述活化剂为氯化钠含量为5％
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15％(w/v)的氯化钠水溶液；(2)浸泡的条件包括：温度为15℃
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30℃，时间为0.5h
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1.5h；和，(3)去除活化剂的方法包括离心，离心的转速为8000rpm
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12000rpm，离心的时间为4min
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6min。4.根据权利要求1所述的酱醪中微生物总DNA的提取方法，其特征在于，所述吐温80 水溶液满足如下条件中的一个或者多个：(1)所述吐温80水溶液中吐温80的含量为0.2％
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【专利技术属性】
技术研发人员：鲁骞，侯莎，童星，
申请(专利权)人：天典广东生物科技有限公司天典生物科技有限公司佛山市海天高明调味食品有限公司佛山市海天调味食品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：