一种油莎豆原生质体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种油莎豆原生质体的制备方法，包括以下步骤：(1)分别油莎豆幼嫩根、芽、叶片、茎、匍匐茎和分蘖节6个不同组织；(2)快速将所述组织切成细条或薄片，然后迅速将其转移至盛有酶解液的细胞培养板中，使其完全沉浸于酶解液中；(3)将细胞培养板置于摇床上，避光酶解；(4)将酶解后的酶解液用尼龙网筛过滤，过滤后将残渣夹回原生质体容器中，然后用W5溶液洗涤后再次过滤，直至将残渣充分洗涤，最后再用尼龙网将滤液重复过滤得最终滤液；(5)将最终滤液进行离心，倒掉所述上清液，用W5溶液稀释重悬所述原生质体沉淀，得所述油莎豆原生质体。本发明专利技术的制备方法有效地解决了油莎豆原生质体制备效率低、完整性差的难题。完整性差的难题。完整性差的难题。

【技术实现步骤摘要】
一种油莎豆原生质体的制备方法


[0001]本专利技术属于植物原生质体制备
，具体涉及一种油莎豆原生质体的制备方法。

技术介绍

[0002]油莎豆(Cyperus esculentus L.)为莎草科莎草属植物，又名虎坚果、铁荸荠和油莎草等，是一种非传统的地下块茎类作物，其圆形或椭圆形豆状块茎积累大量油脂，且产量和出油率高，抗逆性及适应性强，能于沙化、荒漠、盐碱化等土壤种植，不与粮食争地，是一种发展潜力巨大、综合利用价值极高的特色油料作物。
[0003]原生质体是指去除细胞壁后由质膜包裹的裸露细胞。原生质体由于没有细胞壁，更易摄取外源遗传物质，是进行基因功能研究和遗传转化的理想受体。同时原生质体具有细胞全能性，可再生分化成完整的植株，因此，原生质体的制备及培养是植物繁殖和再生的重要途径。利用原生质体融合进行体细胞杂交，可解决油莎豆有性杂交困难的育种问题，此外，原生质体也是遗传基础研究的重要材料，借助原生质体可对油莎豆基因进行亚细胞定位以及蛋白间的相互作用等研究，从而为揭示油莎豆基因功能奠定基础。因而，油莎豆原生质体的高质量高效率的制备是这些研究顺利开展的前提。目前，许多模式植物和粮食作物例如烟草、拟南芥、玉米、水稻等的原生质体制备技术已非常完善，但国内外关于油莎豆原生质体制备的研究尚未见报道。
[0004]油莎豆叶片窄长坚硬，表面覆盖较厚的腊质层，且具有“空腔”结构。目前，拟南芥和玉米都是采用其叶片进行原生质体的制备，参照上述拟南芥和玉米原生质体的制备方法，利用油莎豆叶片进行原生质体制备时，发现油莎豆叶片细胞数少且栅栏组织较难裂解，原生质体释放量少、完整性差，无法满足后续试验要求。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种油莎豆原生质体的制备方法。该制备方法结合油莎豆自身的形态结构和生理生长特点，探索出适用于油莎豆原生质体制备的最佳组织材料，为油莎豆基因功能研究、品种遗传改良等提供一定技术和材料支撑。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种油莎豆原生质体的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)分别选取长势好、健壮一致的油莎豆幼嫩根、芽、叶片、茎、匍匐茎和分蘖节6个不同组织；
[0009](2)选用锋利的刀片快速将步骤(1)中所取的组织切成0.5
‑
1mm宽的细条或薄片，然后迅速将所述细条或薄片转移至盛有酶解液的12孔细胞培养板中，使其完全沉浸于酶解液中；
[0010](3)将步骤(2)中的细胞培养板置于摇床上，避光酶解；
[0011](4)将步骤(3)中酶解后的酶解液用W5溶液浸湿的800目的尼龙网筛过滤，过滤后将残渣夹回原生质体容器中，然后用适量体积W5溶液洗涤后再次过滤，重复3
‑
5次，直至将残渣充分洗涤，原生质体全部过滤干净，最后再用1000目尼龙网将滤液重复过滤2
‑
3次，得最终滤液；
[0012](5)将步骤(4)中所得的最终滤液进行离心，得上清液和油莎豆原生质体沉淀，倒掉所述上清液，用W5溶液稀释重悬所述原生质体沉淀，得所述油莎豆原生质体。
[0013]进一步的，所述步骤(1)中选取6个不同组织的具体方法为：将油莎豆块茎置于30℃无菌水中浸种48h后，移至沙土中于光照培养箱培养，待油莎豆芽长为0.5
‑
1.0cm时，取其幼嫩的根和芽；幼嫩叶片和茎取于发芽7
‑
10天的油莎豆苗；分蘖节取于发芽15
‑
18天的油莎豆苗；油莎豆匍匐茎伸长初期，取长度为0.5
‑
1.0cm的幼嫩匍匐茎。
[0014]进一步的，所述步骤(2)中选取的组织为分蘖节。
[0015]进一步的，所述步骤(2)中刀片切组织的方法为：首先将刀片用75％乙醇消毒；然后在切前将油莎豆植株外部老叶及叶鞘拨除，再用消毒后的刀片切取消毒后的刀片切露出的幼嫩分蘖节。
[0016]进一步的，所述步骤(2)中酶解液的制备方法为：首先，将加入质量体积比为0.5
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2.0％纤维素酶、质量体积比为0.3
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1.2％离析酶、100mM 2
‑
(N
‑
吗啡啉)乙磺酸和质量体积比为8％
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12％甘露醇的容器进行水浴加热8
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10min；然后冷却至室温加入0.1％牛血清蛋白和1mM氯化钙，再用ddH2O定容后将pH调制至5.2
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6.6；最后用0.45μm滤膜过滤灭菌，即得所述酶解液。
[0017]进一步的，所述纤维素酶质量体积比为2％、离析酶质量体积比为0.9％、甘露醇质量体积比为11％；所述pH为6.0。
[0018]进一步的，所述步骤(3)中摇床的工作条件为20
‑
30℃，转速为30
‑
50rpm。
[0019]进一步的，所述步骤(3)中避光酶解的时间为2
‑
12h。
[0020]进一步的，所述避光酶解的时间为6h。
[0021]进一步的，所述步骤(4)中W5溶液的制备方法为：首先将154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾和2mM 2
‑
(N
‑
吗啡啉)乙磺酸溶于水中，得混合溶液，然后用氢氧化钾将所述混合溶液的pH调至5.8，即得所述W5溶液。
[0022]进一步的，所述步骤(5)中离心的转速为600
‑
900rpm，离心时间为5
‑
6min。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具备的积极有益效果在于：
[0024](1)不同组织材料细胞结构和数目不同，原生质体在酶解时释放的难易程度和数量存在差异，本专利技术在制备油莎豆原生质体时选取的分蘖节组织分生能力强、细胞数多、无“空腔”结构，酶解分离的原生质体效果最佳。植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶等组分构成，但不同植物间各组分比例不同。纤维素酶能够酶解纤维素；离析酶是复合酶，能够酶解半纤维素和果胶。利用纤维素酶和离析酶进行酶解分离原生质体时，酶组合浓度比例会影响原生质体释放量，通过本专利技术实施例中的试验可以证明质量体积比为2％纤维素酶+质量体积比为0.9％离析酶组合时，油莎豆原生质体制备的效果最佳。适宜的酶解时间对原生质体制备十分关键，酶解时间短则酶解不彻底，酶解时间长会对原生质体产生伤害，原生质体易破碎，通过本专利技术实施例中的试验可以证明酶解时间为6h时，油莎豆原生质体制备的效果最佳。酶解液的pH值对维持质膜的稳定性及酶的活性起到重要作用，pH值过高
会导致原生质体失水皱缩，pH值过低则会使其涨破失活，通过本专利技术实施例中的试验可以证明pH为6.0时，合时，油莎豆原生质体制备的效果最佳。甘露醇作为酶解液渗透压稳定剂，浓度的高低影响渗透压，而渗透压过低或过高会导致原生质体受到渗透胁迫毒害，进而影响原生质体的产量，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别选取长势好、健壮一致的油莎豆幼嫩根、芽、叶片、茎、匍匐茎和分蘖节6个不同组织；(2)选用锋利的刀片快速将步骤(1)中所取的组织切成0.5
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1mm宽的细条或薄片，然后迅速将所述细条或薄片转移至盛有酶解液的12孔细胞培养板中，使其完全沉浸于酶解液中；(3)将步骤(2)中的细胞培养板置于摇床上，避光酶解；(4)将步骤(3)中酶解后的酶解液用W5溶液浸湿的800目的尼龙网筛过滤，过滤后将残渣夹回原生质体容器中，然后用适量体积W5溶液洗涤后再次过滤，重复3
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5次，直至将残渣充分洗涤，原生质体全部过滤干净，最后再用1000目尼龙网将滤液重复过滤2
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3次，得最终滤液；(5)将步骤(4)中所得的最终滤液进行离心，得上清液和油莎豆原生质体沉淀，倒掉所述上清液，用W5溶液稀释重悬所述原生质体沉淀，得所述油莎豆原生质体。2.根据权利要求1所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中选取6个不同组织的具体方法为：将油莎豆块茎置于30℃无菌水中浸种48h后，移至沙土中于光照培养箱培养，待油莎豆芽长为0.5
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1.0cm时，取其幼嫩的根和芽；幼嫩叶片和茎取于发芽7
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10天的油莎豆苗；分蘖节取于发芽15
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18天的油莎豆苗；油莎豆匍匐茎伸长初期，取长度为0.5
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1.0cm的幼嫩匍匐茎。3.根据权利要求1所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中选取的组织为分蘖节。4.据权利要求1所述的一种油莎豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中刀片切组织的方法为：首先将刀片用75％乙醇消毒；然后在切前将油莎豆植株外部老叶及叶鞘拨除，再用消毒后的刀片切取消毒后的刀片切露出的幼嫩分蘖节。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：张向歌，王会伟，朱雅婧，李春鑫，王艳，李居政，王晓青，
申请(专利权)人：河南省农业科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：