一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法技术

本发明专利技术公开了一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，首先对样品DNA的I型整合子进行PCR扩增，对I型整合子的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化，而后以该切胶纯化产物为模板进行定量PCR的分析，从而对I型整合子携带的抗生素抗性基因进行检测，并进行基因在I型整合子上相对丰度的分析与比较，从而掌握抗生素抗性基因在I型整合子上的相对丰度特征。以PCR为基础，避免了使用宏基因组测序分析难度大、数据挖潜困难、定量分析程度不足的问题；本发明专利技术为环境样品I型整合子抗生素抗性基因的相对丰度分析，提供了新的技术方法和研究方向。新的技术方法和研究方向。新的技术方法和研究方向。

【技术实现步骤摘要】
一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法


[0001]本专利技术属于抗生素抗性基因检测
，具体涉及一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法。

技术介绍

[0002]环境微生物抗生素抗性的发展严重威胁人类健康，引起了人们极大的关注。I型整合子是携带抗生素抗性基因的重要遗传元件，也是引发多重抗生素抗性的重要原因，使用便捷的方法分析环境样品I型整合子携带的抗生素抗性基因特征十分必要。但目前缺乏方便快捷的I型整合子携带抗生素抗性基因的分析方法。
[0003]对基因定量常使用定量PCR，但单纯采用对抗生素抗性基因的定量PCR，难以区分是整合子还是在其他DNA片段上携带的抗性基因。而单纯采用对整合子的PCR，又仅能对该样品是否存在整合子进行定性分析。如中国专利ZL201010140309.2一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法，公开了一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法，采用I型、II型、III型整合酶基因的引物对对细菌是否含有I型、II型、III型整合子进行检测，该方法仅能进行是否存在整合子的初步定性判断，并不能对整合子是否含有目标抗生素抗性基因(ARGs)以及目标ARGs的丰度进行有效的定性和定量检测。
[0004]采用宏基因组分析的手段，可以在宏基因组数据中挖掘整合子所携带抗性基因的信息，但技术难度大，分析过程复杂，数据出现分析错误的概率较高，定量分析程度低，分析周期长，难以广泛应用。
[0005]通过传统的克隆文库方法进行整合子基因和序列的分析，又由于克隆文库整体分析通量较低，对于整合子的解析深度不够，其携带的抗生素抗性基因分析不够全面，也无法获得定量的数据。
[0006]因此，对于整合子携带抗生素抗性基因(ARGs)的定量检测方法是本领域的重点研究方向，具有重要的前景意义。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，掌握抗生素抗性基因在I型整合子上的相对丰度特征。
[0008]技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0009]本专利技术的第一个目的是，提供一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，包括以下步骤：
[0010](1)提取样品的DNA；
[0011](2)所述DNA的I型整合子进行PCR扩增，得I型整合子扩增产物；
[0012](3)所述I型整合子扩增产物进行纯化回收，得纯化回收产物；
[0013](4)以所述纯化回收产物为模板进行定量PCR定量检测；
[0014](5)根据定量PCR定量检测结果，计算I型整合子在整合子上的相对丰度。
[0015]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中，所述提取样品的DNA的方法包括：将样品在10000r/min下离心10min，倒干上清液，使用PowerSoil DNA Isolation Kit提取DNA。
[0016]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述样品包括污泥样品、污水样品、土壤样品、沉积物样品等环境样品。
[0017]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系包含2
×
TransStart FastPfu PCR SuperMix(
‑
dye)12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。
[0018]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述上下游引物包括：上游引物GGCATCCAAGCAGCAAG，下游引物AAGCAGACTTGACCTGA。
[0019]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述PCR扩增的温度程序为95℃10min；35
×
(94℃30s，55℃30s，72℃2min30s)，72℃10min。
[0020]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)中，所述纯化回收的方法包括：所述I型整合子扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，再进行切胶纯化。
[0021]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述琼脂糖凝胶电泳的方法包括：1体积当量的质量体积分数为1％
‑
1.5％(单位为g/mL)的琼脂糖凝胶完全融化，冷却但未凝固前加入0.0001体积当量的SYBR Safe DNA Gel Stain，摇匀后倒入制胶板，待凝固后放入电泳槽中，将所述I型整合子扩增产物依次加入至凝胶孔内，在150V条件下跑胶30min。
[0022]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述切胶纯化的方法包括：使用产物切胶回收试剂盒将整合子条带从200bp
‑
4500bp的位置切胶回收并纯化。
[0023]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)中，所述定量PCR定量检测的体系包括：
[0024]1×
PowerUp SYBR Green Master Mix，
[0025]1mg/mL牛血清白蛋白，
[0026]500nM目标抗性基因前引物，
[0027]500nM目标抗性基因后引物，
[0028]10
‑
20ng/L DNA模板，所述DNA模板为所述I型整合子扩增产物的纯化回收产物。
[0029]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述定量PCR定量检测的反应程序为：预热95℃，10min；变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，40s；共40个循环。
[0030]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，步骤(5)中，所述I型整合子的相对丰度的计算方法包括：ARGs定量PCR测试单位体积拷贝数/单位体积I型整合子浓度，单位为copie/ng I型整合子。
[0031]本专利技术的第二个目的是，提供上述的方法的应用，具体为应用于抗生素抗性基因检测领域。
[0032]有益效果：本专利技术提供的一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，具有以下优势：
[0033](1)以PCR为基础，避免了使用宏基因组测序分析难度大、数据挖潜困难、定量分析
程度不足的问题；
[0034](2)通过对I型整合子进行扩增纯化并作为后续定量PCR模板的方式，克服了直接定量PCR无法区分ARGs是否为I型整合子携带的困扰；
[0035](3)采用定量PCR分析，克服了克隆文库分析通量低，无法定量，基因分析不足的问题；
[0036](4)本专利技术为环境样品I型整合子抗生素抗性基因的相对丰度分析，提供了新的技术方法和研究方向。
附图说明
[0037]图1为实施例1中I型整合子PCR扩增产物电泳图；
[0038]图2为实施例1中样品I型整合子中检出ARGs相对丰度图；
[0039]图3为实施例2中I型整合子PCR扩增产物电泳图；
[0040]图4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环境样品I型整合子携带抗生素抗性基因相对丰度分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样品的DNA；(2)所述DNA的I型整合子进行PCR扩增，得I型整合子扩增产物；(3)所述I型整合子扩增产物进行纯化回收，得纯化回收产物；(4)以所述纯化回收产物为模板进行定量PCR定量检测；(5)根据定量PCR的定量检测结果，计算I型整合子在整合子上的相对丰度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系包含2
×
TransStart FastPfu PCR SuperMix(
‑
dye)12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上下游引物包括：上游引物GGCATCCAAGCAGCAAG，下游引物AAGCAGACTTGACCTGA。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的温度程序为95℃10min；35
×
(94℃30s，55℃30s，72℃2min30s)，72℃10min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述纯化回收的方法包括：所述I型整合子扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，再进行切胶纯化。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳的方法包括：1体积当量的质量体积分数为1％
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张衍，刘和，邱旭阳，郑志永，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：