组培培养基、青杨雌株再生体系和转基因株系建立的方法技术

本发明专利技术公开一种用于青杨雌株的组培培养基及其应用，青杨雌株再生体系建立的方法以及青杨雌株转基因株系建立的方法。其中，用于青杨雌株的组培培养基，包括用于诱导外植体形成愈伤组织的愈伤组织诱导培养基、用于诱导愈伤组织生长不定芽的愈伤组织分化培养基和用于诱导不定芽生根的生根培养基；愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L～0.3mg/L+IBA 0.3mg/L～0.5mg/L；愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6

【技术实现步骤摘要】
组培培养基、青杨雌株再生体系和转基因株系建立的方法


[0001]本专利技术涉及植物培养领域，尤其涉及一种用于青杨雌株的组培培养基及其应用，一种青杨雌株再生体系建立的方法以及一种青杨雌株转基因株系建立的方法。

技术介绍

[0002]杨树即杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)植物的统称，由于适应性强、分布广泛、再生能力强、树干直、成材快、基因组相对较小等特点，杨树在全球范围内都有大量种植，且在毛果杨基因组首次测序完成后，一直被作为林木分子研究的模式植株。青杨(Populus cathayana)性喜湿润或干燥寒冷的气候，木材纹理直，结构细，易加工，在我国各地常作人工林和行道树种植，在保障国家木材安全战略储备中具有重要地位。同时青杨也具备病虫害严重、对土壤营养成分依赖性强等缺点，通过育种获得性状优良的青杨品种对于提高青杨人工林成林速度，提高人工林产量具有重要意义。
[0003]对于生长周期较长的木本植物使用常规的杂家育种往往耗时极长，而诱变育种又突变频率低且变异方向不确定。随着基因工程技术的快速发展，分子遗传育种开始逐渐成为重要的物种遗传改良手段。通过基因工程的方式将基因导入或敲除，从而定向培育遗传新品种，可以高效迅速地获得性状优良的青杨品种，提高人工林产量加速极端地区的绿化工程。
[0004]目前，多种杨树已经完成了全基因组测序，大量杨树基因功能被研究，三倍体毛白杨、杂交银腺杨84K和杂交黑杨南林895已经具有成熟的遗传转化体系，但是关于离体再生能力相对较弱青杨的遗传转化体系建立的研究报告相对较少，因此急需建立青杨的稳定高效的遗传转化体系，为青杨在分子水平遗传改良提供理论依据和技术保障，对于杨树的分子研究成果的生产应用具有重要意义。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种用于青杨雌株的组培培养基。
[0006]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种用于青杨雌株的组培培养基，包括用于诱导外植体形成愈伤组织的愈伤组织诱导培养基、用于诱导愈伤组织生长不定芽的愈伤组织分化培养基和用于诱导不定芽生根的生根培养基；
[0007]所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L～0.3mg/L+IBA 0.3mg/L～0.5mg/L；
[0008]所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6
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BA 0.1mg/L～0.7mg/L+IBA0.1mg/L～0.7mg/L；
[0009]所述生根培养基由以下物质组成：1/2MS 2.87g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L，或者，所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L。
[0010]作为一种实施方式，所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L+IBA0.3mg/L；且/或，
[0011]所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6
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BA 0.1mg/L+IBA 0.5mg/L；且/或，
[0012]所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L。
[0013]作为一种实施方式，所述愈伤组织诱导培养基、所述愈伤组织分化培养基和所述生根培养基的pH值均为5.8。
[0014]本专利技术的目的之二在于提供一种用于青杨雌株的组培培养基在建立青杨雌株再生体系中的应用。
[0015]本专利技术的目的之三在于提供一种青杨雌株再生体系建立的方法，包括以下步骤：
[0016]1)外植体的选择和灭菌：选取青杨雌株叶片作为外植体，用自来水冲洗后在无菌环境下置于无菌瓶中，乙醇消毒、无菌水清洗后，用NaClO消毒、无菌水清洗，再用无菌滤纸吸干外植体材料表面的水分后，用无菌解剖刀将外植体切割成小块，并在块状外植体的背面切割数个伤口；
[0017]2)愈伤组织诱导：将步骤1)得到的块状外植体接种到固态的愈伤组织诱导培养基中，在黑暗环境中培养20天～30天，诱导出愈伤组织；其中，所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L～0.3mg/L+IBA 0.3mg/L～0.5mg/L，小块的叶片接种到所述愈伤组织诱导培养基上时，近轴面向上正置于所述愈伤组织诱导培养基上；
[0018]3)分化培养：将步骤2)形成的愈伤组织接种到愈伤组织分化培养基上，培养25天～35天，培养出青杨雌株不定芽；其中，所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6
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BA 0.1mg/L～0.7mg/L+IBA 0.1mg/L～0.7mg/L；
[0019]4)生根培养：将步骤3)形成的青杨雌株不定芽取出，切下2cm～3cm的芽转接入生根培养基中，培养25天～35天，得到生根的青杨雌株无菌组培苗；其中，所述生根培养基由以下物质组成：1/2MS 2.87g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L，或者，所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L；
[0020]5)组培苗炼苗移栽：将苗高在4.5cm～5.5cm青杨雌株组培苗移栽到无菌土中，上覆保鲜膜保湿，7天后开始逐渐部分掀开保鲜膜，直到幼苗叶片完全暴露在空气中不会脱水。
[0021]作为一种实施方式，所述步骤1)中选择1个月大扦插苗顶端2～3片幼嫩叶片作为外植体；且/或，
[0022]所述步骤1)中采用75％乙醇对外植体消毒30s，且/或，
[0023]所述步骤1)中采用2％NaClO对外植体消毒5min，且/或，
[0024]所述步骤1)中用无菌解剖刀将外植体切割成大小为1
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1cm的小块。
[0025]作为一种实施方式，所述步骤2)中采用的所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L+IBA0.3mg/L；且/或，
[0026]所述步骤2)中采用的所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8；且/或，
[0027]所述步骤2)中的所述黑暗环境中温度为25℃，湿度为70％。
[0028]作为一种实施方式，所述步骤3)中采用的所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于青杨雌株的组培培养基，其特征在于，包括用于诱导外植体形成愈伤组织的愈伤组织诱导培养基、用于诱导愈伤组织生长不定芽的愈伤组织分化培养基和用于诱导不定芽生根的生根培养基；所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L～0.3mg/L+IBA 0.3mg/L～0.5mg/L；所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6
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BA 0.1mg/L～0.7mg/L+IBA 0.1mg/L～0.7mg/L；所述生根培养基由以下物质组成：1/2MS 2.87g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L，或者，所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L。2.根据权利要求1所述的用于青杨雌株的组培培养基，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L+IBA0.3mg/L；且/或，所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6
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BA 0.1mg/L+IBA 0.5mg/L；且/或，所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L。3.一种青杨雌株再生体系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)外植体的选择和灭菌：选取青杨雌株叶片作为外植体，用自来水冲洗后在无菌环境下置于无菌瓶中，乙醇消毒、无菌水清洗后，用NaClO消毒、无菌水清洗，再用无菌滤纸吸干外植体材料表面的水分后，用无菌解剖刀将外植体切割成小块，并在块状外植体的背面切割数个伤口；2)愈伤组织诱导：将步骤1)得到的块状外植体接种到固态的愈伤组织诱导培养基中，在黑暗环境中培养20天～30天，诱导出愈伤组织；其中，所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L～0.3mg/L+IBA 0.3mg/L～0.5mg/L，小块的叶片接种到所述愈伤组织诱导培养基上时，近轴面向上正置于所述愈伤组织诱导培养基上；3)分化培养：将步骤2)形成的愈伤组织接种到愈伤组织分化培养基上，培养25天～35天，培养出青杨雌株不定芽；其中，所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6
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BA 0.1mg/L～0.7mg/L+IBA 0.1mg/L～0.7mg/L；4)生根培养：将步骤3)形成的青杨雌株不定芽取出，切下2cm～3cm的芽转接入生根培养基中，培养25天～35天，得到生根的青杨雌株无菌组培苗；其中，所述生根培养基由以下物质组成：1/2MS 2.87g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L，或者，所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L；5)组培苗炼苗移栽：将苗高在4.5cm～5.5cm青杨雌株组培苗移栽到无菌土中，上覆保鲜膜保湿，7天后开始逐渐部分掀开保鲜膜，直到幼苗叶片完全暴露在空气中不会脱水。4.根据权利要求3所述的青杨雌株再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤1)中选择1个月大扦插苗顶端2～3片幼嫩叶片作为外植体；且/或，
所述步骤1)中采用75％乙醇对外植体消毒30s，且/或，所述步骤1)中采用2％NaClO对外植体消毒5min，且/或，所述步骤1)中用无菌解剖刀将外植体切割成大小为0.5
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0.5cm2的小块。5.根据权利要求3所述的青杨雌株再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：张胜，陈遥，夏林超，孔祥阁，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
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