双功能萜合酶及其突变体以及催化产物5-15环系二倍半萜类化合物制造技术

本发明专利技术涉及双功能萜合酶及其突变体以及催化产物5

【技术实现步骤摘要】
双功能萜合酶及其突变体以及催化产物5
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15环系二倍半萜类化合物


[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其是涉及一种双功能萜合酶及其突变体以及催化产物5
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15环系二倍半萜类化合物。

技术介绍

[0002]萜合酶是萜类化合物生物合成途径中一类重要的酶，负责将萜类线性前体环化形成具有不同环系及对映立体中心的结构。萜合酶复杂精密的催化决定了萜类化合物丰富多样的结构骨架。迄今为止已存在超过80,000种萜类化合物，约占所有天然产物数量的1/3，具有广泛的生物学活性，其中不乏许多著名药物分子，如抗疟疾的青蒿素，抗肿瘤的紫杉醇，抗肝炎药物甘草酸等。
[0003]双功能萜合酶主要来源于真菌，同时具有异戊烯基转移酶(prenyltransferase，PT)结构域和萜类环化酶(terpene cyclase，TC)结构域，因此兼具萜类合成前体二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)首尾相连和环化的双重功能。目前为止，真菌来源双功能萜合酶的催化产物均为二萜和二倍半萜，且多为三环或四环。根据催化机制可知，PT结构域决定了催化合成萜类化合物的碳链长度，而TC结构域则对产物的环系骨架和立体构型起关键作用，且随着环化反应中间体上碳正离子的迁移，产物的环系结构也将逐渐趋于复杂。然而，由于高能碳正离子中间体的存在，环化过程瞬息万变、难以捕捉，也为双功能萜合酶催化机制的研究带来困难。同时，由于双功能萜合酶双结构域及多个柔性区域的存在，蛋白质晶体结构的获取和解析也十分困难，目前为止仍未有一例双功能萜合酶全酶晶体结构，即使是截短的TC结构域也仅有一例，因此，该领域中关于酶的结构和功能关系的了解较为有限。
[0004]蛋白质工程方法包括定向进化、理性设计和半理性设计。由于双功能萜合酶蛋白晶体的不足，目前仍缺乏对其空间结构和功能关系的深入认知，理性设计无从下手，且成功率较低，因此并不适用。定向进化是常用的对酶蛋白进行改造和筛选的有效手段，但其随机突变的特性往往导致突变库过于庞大，具有成本高、效率低、周期长等弊端。近年逐渐发展起来的半理性设计采用生物信息学的手段，通过同源蛋白序列比对、蛋白空间立体结构的比较，同时参考已知催化机制等信息，理性选择蛋白质的改造靶点和替代密码子，从而构建较为精简的突变体文库，更有针对性地改造蛋白质。因此，根据有限的双功能萜合酶结构和催化方面的信息，设计和构建高效突变体库，对更加深入了解萜合酶结构与功能的关系，有效扩充萜类天然产物库，增添更多具潜在药物价值萜类化合物后备军具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种双功能萜合酶及其突变体以及催化产物5
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15环系二倍半萜类化合物。
[0006]本专利技术通过对一种双功能萜合酶进行突变，得到双功能萜合酶突变体，该双功能
萜合酶突变体能够催化复杂结构的二倍半萜类化合物。通过双功能萜合酶催化功能的改造和突变产物的获得，更加深入了解萜合酶结构与功能的关系，有效扩充萜类天然产物库，增添更多具潜在药物价值萜类化合物后备军。
[0007]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0008]本专利技术首先提供一种双功能萜合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术还提供一种双功能萜合酶突变体，是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位置的丝氨酸(Serine)突变为亮氨酸(Leucine)后获得的如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列对应的蛋白质。
[0010]其中，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列是筛选自小麦根腐平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana BS11134(保藏编号：CGMCC No.17767)的双功能萜合酶的氨基酸序列。其中，所述小麦根腐平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana BS11134，已于2019年04月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，在中国专利CN110272345A中有记载。
[0011]本专利技术还提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述双功能萜合酶，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]本专利技术还提供另一种分离的核酸，所述核酸编码所述双功能萜合酶突变体。该分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]本专利技术中提供的双功能萜合酶以及双功能萜合酶突变体是同时具有异戊烯基转移酶结构域和萜类环化酶结构域的二倍半萜合酶。
[0014]本专利技术还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码双功能萜合酶或双功能萜合酶突变体的核酸。
[0015]本专利技术还提供一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包含所述的重组表达载体。
[0016]本专利技术还提供双功能萜合酶突变体的催化产物，其中，双功能萜合酶突变体的催化产物2和3为含5
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15
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双环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C
25
H
40
，结构式分别如式2、式3所示；双功能萜合酶突变体的催化产物4，即化合物4为含5
‑6‑8‑5‑
四环二倍半萜骨架的化合物，双功能萜合酶突变体的催化产物5，即化合物5为含5
‑6‑7‑3‑5‑
五环二倍半萜骨架的化合物，二者分子式均为C
25
H
42
O，结构式分别如式4、式5所示。
[0017][0018]在本专利技术的一个实施方式中，双功能萜合酶突变体的催化产物是：双功能萜合酶突变体在酿酒酵母S.cerevisiae BJ5464中体内酶催化反应之后，提取的突变体催化产物。
[0019]由于采用上述技术方案，本专利技术具有以下优点和有益效果：
[0020]本专利技术提供了目标双功能萜合酶在酿酒酵母S.cerevisiae BJ5464中体内酶催化反应之后，提取、检测和制备突变体催化产物。
[0021]本专利技术提供了一种双功能萜合酶高效精简突变库的构建方法，以真菌来源第一例双功能萜合酶PaFS晶体结构为模板，构建BsPS蛋白结构模型，并通过POCASA预测活性催化口袋，排除掉高度保守位点和其他催化关键位点后，选定适当数量的突变位点，获得了“小而精”的突变体文库。
[0022]本专利技术通过双功能萜合酶高效精简突变库的构建和突变产物的检测，改造了双功能萜合酶的催化功能，获得了具丰富环系结构的萜类化合物，对有效扩充萜类天然产物库，增添更多具潜在药物价值萜类化合物后备军具有重要意义。
[0023]本专利技术的改造对象双功能萜合酶BsPS同时具有异戊烯基转移酶结构域以及萜类环化酶结构域，兼具萜类合成前体二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl d本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双功能萜合酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种双功能萜合酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述双功能萜合酶，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求2所述双功能萜合酶突变体，所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含编码权利要求1所述双功能萜合酶的核酸。6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含编码权利要求2所述双功能萜合酶突变体的核酸。7.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含权利要求5所述的重组表达载体。8.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含权利要求6所述的重组表达载体。9.双功能萜合酶突变体的催化产物，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王馨叶，刘雪婷，王芷馨，徐志军，胡轶欧，程泽瀛，曾志建，张立新，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：