一种重组蛋白内毒素的去除方法技术

本发明专利技术涉及一种重组蛋白内毒素的去除方法，其中的高效去内毒素亲和填料FF可以特异性的去除病毒、核酸和蛋白等与重组蛋白结合的内毒素，且其载量较高，稳定性较好不会有脱落，重组蛋白回收率高，从而有效的降低了处理成本；同时，本发明专利技术所采用的方法操作简单，不需要对高效去内毒素亲和填料FF进行装柱，使用方便，可以根据重组蛋白中所含的内毒素总量加入，容易进行工艺放大，采用本发明专利技术的方法对注射用替奈普酶进行纯化处理后，注射用替奈普酶纯度大于98％，内毒素＜0.6eu/mg，收率大于90％，产品的质量得到了极大的提升。的质量得到了极大的提升。

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白内毒素的去除方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其是涉及一种重组蛋白内毒素的去除方法。

技术介绍

[0002]内毒素是一种对人类或动物产生有害影响的热原，因而在生物制品中内毒素的浓度必须低于安全、受管制的水平，故在生产过程需要对生物制品中的内毒素进行去除。内毒素的去除方法有很多，例如超滤法、活性炭吸附法、相分离法、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、亲和吸附法(即在填料表面偶联如多粘菌素B、组胺、组氨酸以及一些聚阳离子等具有特异性结合作用的配位基，从而可以选择性吸附与其可发生特异性结合的物质)，此外还包括金属离子鳌合层析和氢氧化铝吸附法。
[0003]其中注射用替奈普酶目前多采用Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析、lysine HyperD亲和层析两步层析方法进行纯化，两步亲和层析对杂质去除效果较好，且纯化后蛋白纯度、收率较好；但是上述纯化方法对于注射用替奈普酶的内毒素控制只能达到＜2EU/mg的水平，且后续没有内毒素去除工艺，如果上样细胞表达内毒素含量较高，或者在纯化工艺中因缓冲液或器材处理不当，则会导致内毒素超标，采用上述纯化方法则不能很好的对注射用替奈普酶中的内毒素进行去除。
[0004]因此，有必要提供一种新的技术方案以克服上述缺陷。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种重组蛋白内毒素的去除方法，其可以用于在注射用替奈普酶生产过程中对内毒素进行去除，且内毒素的去除效果优于现有技术。
[0006]为达到本专利技术之目的，采用如下技术方案：
[0007]一种重组蛋白内毒素的去除方法，包括如下步骤：
[0008]步骤1：将待处理的细胞上清液进行预处理，得到预处理液；
[0009]步骤2：将所述预处理液经Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析后，用洗脱液A洗脱得到Blue层析目的蛋白溶液；
[0010]步骤3：将所述Blue层析目的蛋白溶液经lysine HyperD亲和层析后，用洗脱液B洗脱得到Lysine层析目的蛋白溶液；
[0011]以及，步骤4：在所述Lysine层析目的蛋白溶液中加入高效去内毒素亲和填料FF进行纯化，而后经0.22um滤器除菌过滤，即得纯化后的注射用替奈普酶。
[0012]优选的，所述步骤1中采用0.45滤器对所述待处理的细胞上清液进行预处理。
[0013]优选的，所述步骤2中洗脱液A的组分为：10
‑
50mM磷酸盐缓冲液、0.043％聚山梨酯20、0.5
‑
1M氯化钠、2
‑
4M尿素、5
‑
10mg/L抑肽酶。
[0014]优选的，所述洗脱液A的pH值为7.2
‑
8.0，其用量是柱体积的3
‑
5倍。
[0015]优选的，所述步骤3中洗脱液B的组分为：0.2
‑
1.0M精氨酸、0.1
‑
0.5M氨基己酸、0.043％聚山梨酯20、6
‑
10mg/L抑肽酶、5
‑
18mg/mL磷酸。
[0016]优选的，所述洗脱液B的pH值为7.4
‑
7.8，其用量是柱体积的3
‑
5倍。
[0017]优选的，所述步骤4中，所述高效去内毒素亲和填料FF的吸附载量为10000
‑
14000eu/mL。
[0018]优选的，所述步骤4中，所述高效去内毒素亲和填料FF在使用前需要使用平衡缓冲液C对其进行处理。
[0019]优选的，所述平衡缓冲液C的组分为：1％脱氧胆酸钠，10
‑
50mM磷酸盐缓冲液。
[0020]优选的，所述平衡缓冲液C的pH值为6.8
‑
7.4，用量为所需处理的填料体积的5
‑
10倍。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0022]本专利技术所采用的内毒素去除方法，其中的高效去内毒素亲和填料FF可以特异性的去除病毒、核酸和蛋白等与重组蛋白结合的内毒素，且其载量较高，稳定性较好不会有脱落，重组蛋白回收率高，从而有效的降低了处理成本；同时，本专利技术所采用的方法操作简单，不需要对高效去内毒素亲和填料FF进行装柱，使用方便，可以根据重组蛋白中所含的内毒素总量加入，容易进行工艺放大，采用本专利技术的方法对注射用替奈普酶进行纯化处理后，注射用替奈普酶纯度大于98％，内毒素＜0.6eu/mg，收率大于90％，产品的质量得到了极大的提升。
具体实施方式
[0023]为了使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本专利技术的部分实施例，而不是全部实施例。
[0024]本专利技术提供的一种重组蛋白内毒素的去除方法，包括如下步骤：
[0025]步骤1：将待处理的细胞上清液使用0.45滤器进行预处理，得到预处理液。
[0026]步骤2：将所述预处理液经Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析后，用洗脱液A洗脱得到Blue层析目的蛋白溶液；
[0027]其中，Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析对注射用替奈普酶蛋白结合载量为10
‑
20mg/mL；洗脱液A的组分为：10
‑
50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、0.5
‑
1M氯化钠、2
‑
4M尿素和5
‑
10mg/L抑肽酶，pH值为7.2
‑
8.0，其用量是柱体积的3
‑
5倍；
[0028]且在Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析上样前和上样后，均需要使用平衡缓冲液A进行柱平衡，平衡缓冲液A的组分为10
‑
50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、0.1
‑
0.5M氯化钠和1
‑
3mg/L抑肽酶，pH值为7.2
‑
8.0，其用量是柱体积的3
‑
5倍；
[0029]同时，在Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析洗脱活性峰前，需要使用杂质洗脱液A进行杂质洗脱，杂质洗脱液A的组分为：10
‑
50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、1
‑
3M氯化钠和1
‑
3mg/L抑肽酶，pH值为7.2
‑
8.0，其用量是柱体积的5
‑
10倍。
[0030]步骤3：将所述Blue层析目的蛋白溶液经lysine HyperD亲和层析后，用洗脱液B洗脱得到Lysine层析目的蛋白溶液；
[0031]其中，在进行lysine HyperD亲和层析上样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：将待处理的细胞上清液进行预处理，得到预处理液；步骤2：将所述预处理液经Blue SepHarose 6 FastFlow亲和层析后，用洗脱液A洗脱得到Blue层析目的蛋白溶液；步骤3：将所述Blue层析目的蛋白溶液经lysine HyperD亲和层析后，用洗脱液B洗脱得到Lysine层析目的蛋白溶液；以及，步骤4：在所述Lysine层析目的蛋白溶液中加入高效去内毒素亲和填料FF进行纯化，而后经0.22um滤器除菌过滤，即得纯化后的注射用替奈普酶。2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤1中采用0.45滤器对所述待处理的细胞上清液进行预处理。3.根据权利要求1所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤2中洗脱液A的组分为：10
‑
50mM磷酸盐缓冲液、0.043％聚山梨酯20、0.5
‑
1M氯化钠、2
‑
4M尿素、5
‑
10mg/L抑肽酶。4.根据权利要求3所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述洗脱液A的pH值为7.2
‑
8.0，其用量是柱体积的3
‑
5倍。5.根据权利要求1所述的一种重组蛋白内毒素...

【专利技术属性】
技术研发人员：张慧君，邵恒，张文学，陈太标，花亚东，
申请(专利权)人：江苏丰华生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：