一种融合纳米囊泡及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，具体公开了一种融合纳米囊泡及其制备方法与应用。本发明专利技术的融合纳米囊泡包括间充质干细胞囊泡和植物外泌体融合而成的膜结构。本发明专利技术首次将植物来源的外泌体与人来源的间充质干细胞囊泡进行膜融合制备融合纳米囊泡，本发明专利技术的融合纳米囊泡具有很好的靶向性和生物相容性，该融合纳米囊泡具有抗炎抗氧化作用，并且具有免疫调节功能，能有效治疗特异性皮炎和银屑病，为制备用于治疗自身免疫病特别是特异性皮炎和银屑病的药物提供了一种新来源。的药物提供了一种新来源。的药物提供了一种新来源。

【技术实现步骤摘要】
一种融合纳米囊泡及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种融合纳米囊泡及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]自身免疫病是由于机体免疫系统不能正确识别自身抗原和异己抗原，从而攻击自身组织引发疾病。随着全球年均发病率和患病率稳步上升，自身免疫性疾病已成为仅次于心血管疾病和癌症的第三大慢性病。目前临床上治疗自身免疫病的常用药物是全身免疫抑制剂，如甲氨蝶呤，单克隆抗体，和糖皮质激素。但是这些药物存在耐药性和副作用大的缺点。银屑病和特异性皮炎属于发病率较高的自身免疫病，主要病损部位在皮肤。
[0003]趋化因子CCL20又称巨噬细胞炎性蛋白(MIP
‑
3α)，单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、肥大细胞、角质细胞、成骨细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞都可表达CCL20。CCL20是趋化因子受体CCR6的唯一配体，对淋巴细胞具有强烈的趋化作用，而对中性粒细胞的趋化作用较弱。趋化因子受体CCR6表达在Th17细胞上，而银屑病特异性皮炎等自身免疫病都与Th17细胞密切相关。CCR6
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CCL20轴与自身免疫病密切相关，已有针对CCR6的小分子药物在临床前研究阶段。
[0004]间充质干细胞具有多向分化的功能，是来源于骨髓、脐带、脂肪、牙龈等组织的一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，并能分泌多种细胞因子及生长因子，具有免疫调节、组织修复、抗炎等作用。牙龈间充质干细胞(gingiva
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derived mesenchymal stem cell,GMSC)是从牙龈组织提取的多能干细胞，已被报道治疗多种炎症性疾病。细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是指由细胞分泌的有着膜结构的囊泡状小体，是细胞间通讯的关键信使，由多种细胞分泌，内含有特定的蛋白质、脂质、细胞因子和核酸。
[0005]目前外泌体的应用已经涉及肿瘤治疗领域、医学基础和免疫领域。近几年关于植物外泌体的研究也在不断增加，植物外泌体与动物外泌体结构相似，也含有核酸、脂质和蛋白质等物质。相比于动物外泌体，植物外泌体的来源更多，更容易大批量制备，且免疫原性低，毒性小。但是动物外泌体可以通过基因工程的方法表达各种与疾病相关的蛋白，而植物外泌体难以进行改造和修饰。目前常见的修饰方法如脂质体修饰常常导致植物外泌体形态和活性的改变。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种融合纳米囊泡及其制备方法与应用。本专利技术首次将植物来源的外泌体与人来源的间充质干细胞囊泡进行膜融合制备融合囊泡来治疗自身免疫病。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种融合纳米囊泡，所述融合纳米囊泡包括间充质干细胞囊泡和植物外泌体融合而成的膜结构。研究表明，植物外泌体与动物外泌体结构相似，含有核酸、脂质和蛋白质等物质，并且植物外泌体来源广、免疫原性低，毒
性小，但是存在难以进行修饰的特点。本申请专利技术人经过大量的实验研究和验证，将植物来源的外泌体与人来源的间充质干细胞囊泡进行挤出融合制备得到融合纳米囊泡，该纳米囊泡具有很好的靶向性和生物相容性，并且具有治疗特异性皮炎和银屑病的效果。
[0008]作为本专利技术所述的融合纳米囊泡的优选实施方式，所述间充质干细胞为牙龈间充质干细胞。
[0009]作为本专利技术所述的融合纳米囊泡的优选实施方式，所述牙龈间充质干细胞表达趋化因子受体。
[0010]作为本专利技术所述的融合纳米囊泡的优选实施方式，所述趋化因子受体包括CCR6。本申请专利技术人采用基因工程的方法使牙龈间充质干细胞表达趋化因子CCR6。
[0011]作为本专利技术所述的融合纳米囊泡的优选实施方式，所述植物外泌体为西柚外泌体。本申请专利技术人经过实验筛选和验证，最终选择西柚外泌体与间充质干细胞囊泡制备融合纳米囊泡，西柚外泌体具有来源广、免疫原性低的特点，与间充质干细胞囊泡融合实现了对西柚外泌体的修饰，制备得到的融合纳米囊泡具有更好的生物相容性和疗效。
[0012]作为本专利技术所述的融合纳米囊泡的优选实施方式，所述植物外泌体和间充质干细胞细胞膜的总蛋白含量比为植物外泌体：间充质干细胞细胞膜＝1：2。
[0013]本专利技术还提供所述的融合纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：
[0014](1)提取纯化植物外泌体；
[0015](2)制备过表达趋化因子受体的间充质干细胞细胞膜囊泡；
[0016](3)将植物外泌体和间充质干细胞囊泡混合并经聚碳酸酯膜挤出，得所述融合纳米囊泡。
[0017]本专利技术还提供所述的融合纳米囊泡在制备用于治疗自身免疫病的药物中的应用。
[0018]作为本专利技术所述的应用的优选实施方式，所述自身免疫病包括银屑病或特异性皮炎。
[0019]本专利技术还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括所述的融合纳米囊泡。
[0020]本专利技术的有益效果：本专利技术提供一种融合纳米囊泡及其制备方法与应用。本专利技术首次将植物来源的外泌体与人来源的间充质干细胞囊泡进行膜融合制备融合纳米囊泡，本专利技术的融合纳米囊泡具有很好的靶向性和生物相容性，该融合纳米囊泡具有抗炎抗氧化作用，并且具有免疫调节功能，能有效治疗特异性皮炎和银屑病，为制备用于治疗自身免疫病特别是特异性皮炎和银屑病的药物提供了一种新来源。
附图说明
[0021]图1为实施例1的融合纳米囊泡制备流程示意图；
[0022]图2为CCK
‑
8法检测十种不同来源的植物外泌体对LPS诱导的HaCaT细胞增殖的影响；
[0023]图3为流式检测生姜外泌体和西柚外泌体对LPS诱导的巨噬细胞细胞内ROS水平的影响；
[0024]图4：A为蔗糖梯度离心法纯化后的西柚外泌体；B为GEVs，GEV@CX5461,NVs，CCR6
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NVs，FV@CX5461的电镜图；C为GEVs，GEV@CX5461,NVs，CCR6
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NVs，FV@CX5461的Zeta电位；D为GEVs的粒径分布图；E为融合纳米囊泡(FV@CX5461)的粒径分布图；F为FV@CX5461的共聚焦
显微镜图；G为western blot检测外泌体的标志蛋白以及CCR6受体的表达情况图；H为GEVs包载CX5461的包封率以及FV@CX5461的包封率；
[0025]图5为流式检测RAW264.7细胞内的ROS水平图；
[0026]图6为qPCR实验检测HaCaT细胞炎症因子mRNA水平图；
[0027]图7为流式检测M2型巨噬细胞比例图，其中双阳性细胞(CD206和F4/80)代表M2巨噬细胞；
[0028]图8为流式检测CFSE标记的PBMCs的第七天的增殖情况图；
[0029]图9：A为银屑病模型给药模式图；B为活体成像显示药物分布情况图；C为第7天取样时各组小鼠皮肤代表性照片；D为造模及治疗期间各组小鼠的PA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合纳米囊泡，其特征在于，所述融合纳米囊泡包括间充质干细胞囊泡和植物外泌体融合而成的膜结构。2.根据权利要求1所述的融合纳米囊泡，其特征在于，所述间充质干细胞为牙龈间充质干细胞。3.根据权利要求2所述的融合纳米囊泡，其特征在于，所述牙龈间充质干细胞表达趋化因子受体。4.根据权利要求3所述的融合纳米囊泡，其特征在于，所述趋化因子受体包括CCR6。5.根据权利要求1所述的融合纳米囊泡，其特征在于，所述植物外泌体为西柚外泌体。6.根据权利要求1所述的融合纳米囊泡，其特征在于，所述植物外泌体和间充质干细胞细胞膜的总蛋白含量比为植物外泌体：间...

【专利技术属性】
技术研发人员：程芳，江子斌，黄如凡，陈红波，苏丹丹，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：