一种METTL1和WDR4蛋白复合物的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种METTL1和WDR4蛋白复合物的制备方法，属于分子生物学和结构生物学技术领域，本发明专利技术将METTL1和WDR4选取合适的基因序列克隆到适合其表达的载体中，这种载体需要满足目的蛋白的大量表达与降低蛋白沉降的需求。通过对METTL1和WDR4基因长度进行筛选、克隆载体进行选择、对二者进行共转化共纯化等不同的表达纯化方式的尝试，最终确定了适合复合物蛋白表达和纯化的方法，成功纯化出了单一的复合物蛋白并进行后续晶体实验，对探究m7G46修饰的致癌机制研究和开发靶向药物的关键技术奠定了分子学和结构学基础。定了分子学和结构学基础。定了分子学和结构学基础。

【技术实现步骤摘要】
一种METTL1和WDR4蛋白复合物的制备方法


[0001]本专利技术属于分子生物学和结构生物学
，具体涉及的是一种METTL1和WDR4蛋白复合物的制备方法。

技术介绍

[0002]近年来，科研人员已发现超过150种不同的RNA修饰，这些修饰在细胞活动中发挥着重要作用。据研究表明，所有类型的RNA都能被修饰，其中核糖体RNA (rRNA)和转移RNA (tRNA)的修饰最为广泛。tRNA修饰可以调节tRNA的稳定、mRNA的翻译以及蛋白质合成速率。tRNA修饰酶的突变或异常表达很可能引起一些相关的疾病，例如：如果RNA修饰通路调节发生错误，很可能导致癌症的发生。因此，RNA修饰已经成为了一种治疗癌症的理想靶点。
[0003]m7G是最常见的tRNA修饰之一，其中在tRNA第46号核苷酸发生的修饰是由类甲基转移酶蛋白1（METTL1）和WD重复结构域4（WDR4）异二聚体催化的。METTL1和WDR4蛋白的过表达会驱动致癌转化和肿瘤发生，并导致mRNA翻译的改变。通过对METTL1和WDR4复合物蛋白三维结构的解析可成为探究致癌机制和开发靶向药物的关键，而目前存在的问题是：在蛋白表达与纯化中出现：（1）WDR4蛋白表达量不高；（2）METTL1和WDR4在纯化过程易出现降解；（3）蛋白纯度不够，无法进行蛋白结晶实验，无法对蛋白的结构进行解析。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，通过截取合适基因片段、选择合适表达载体与优化蛋白纯化方式等方法，解决METTL1 和WDR4蛋白在蛋白纯化中出现降解的技术问题，提供一种METTL1和WDR4蛋白复合物的制备方法，从而达到防止蛋白降解和沉淀，使得METTL1与WDR4稳定表达且共纯化，为将来解析METTL1 和WDR4复合物结构奠定夯实的基础。
[0005]本专利技术的设计构思为：受结构生物学与分子生物学的启发，通过摸索不同基因长度和载体条件后，将METTL1和 WDR4选取合适的部分基因序列克隆到适合其表达的载体中，这种载体需要满足目的蛋白的大量表达与降低蛋白沉降的需求。通过对METTL1和WDR4基因长度进行筛选、克隆载体进行选择、对二者进行共转化共纯化等不同的表达纯化尝试，最终确定了适合复合物蛋白表达和纯化的方式，成功进行分子克隆和蛋白表达，为随后对复合物进行结构解析提供基础。
[0006]本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种METTL1和WDR4蛋白复合物的制备方法，包括以下步骤：S1、在NCBI中查找出METTL1和WDR4的全长基因信息，进行化学合成，设计引物通过PCR反应去掉降解片段，分别获得METTL1
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Con基因片段与WDR4
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Con基因片段；S2、首先，将步骤S1获得的基因片段分别以25 uL体系进行PCR反应，反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，对PCR成功的基因片段进行胶回收，分别获得METTL1
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Con目的片段与
WDR4
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Con目的片段；然后将METTL1
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Con目的片段、WDR4
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Con目的片段、PET.32M.3C目的载体与PET.28a目的载体共同进行酶切实验，并再次进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收；S3、将胶回收后的METTL1
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Con目的片段与PET.32M.3C目的载体、WDR4
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Con目的片段与PET.28a目的载体分别在16 ℃进行连接并转化进入大肠杆菌DH5a中，对转化成功的目的片段进行双酶切验证，验证成功后进行质粒测序分析，保证目的基因转入完全正确无突变；S4、将S3中测序成功的质粒共同转化到大肠杆菌BL21中表达；S5、将含METTL1
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Con与WDR4
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Con双质粒的大肠杆菌在含有A
+
和K
+
双抗性的LB中培养，并用IPTG诱导16 h
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20 h，然后离心收集菌液，离心速度为4000 rpm，离心时间为30 min，最后重悬于悬菌液中；S6、将步骤S5重悬的菌液进行超声破菌，并离心收集，离心速度为15000 rpm，离心时间为1 h，最后通过三步纯化法制得METTL1和WDR4蛋白复合物。
[0007]进一步地，在所述步骤S2中，所述琼脂糖凝胶电泳处理包括以下步骤：称取0.5 g的琼脂糖粉剂和体积为50 mL的1XTAE缓冲液加入锥形瓶中，锡纸覆盖于瓶口处，在微波炉中高温加热1 min，待粉剂完全溶解于缓冲液后取出，待混合溶液的温度下降到65 ℃，向锥形瓶中加入5 uL核酸染料，摇晃均匀后倒入膜具，插入13孔齿梳，等待混合溶液凝固；琼脂糖凝胶完全凝固后，加入Marker和待测样品，将凝胶放入电泳槽，在恒压120 V下电泳30 min；电泳完成后取出凝胶，在BIO
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RAD曝光仪中显影。
[0008]进一步地，在所述步骤S5中，所述三步纯化法包括以下步骤：第一步，亲和层析：在装有填料的重力柱中加入上清液，依次经过孵育、挂柱、洗杂、洗脱步骤，将目的蛋白纯化，后加入标签酶进行过夜酶切；第二步，离子交换层析：在含有阴/阳粒子填料的柱子中，通过盐溶液梯度洗脱上一步得到的目的蛋白，收集峰对应的目的蛋白，并浓缩至500 uL；第三步，凝胶过滤层析：将第二步浓缩的目的蛋白加入到含不同孔径填料的柱子中，通过分子筛溶液洗脱，收集峰对应的目的蛋白。
[0009]与现有技术相比本专利技术的有益效果为：本专利技术提供一种简单、高效、方便合成且减少目的蛋白降解的方法。在分子克隆中，通过对目的蛋白分子降解部分的分析、合理截短，改换合适表达的目的载体等方式，以及在蛋白纯化中加入目的蛋白的分子伴侣，二者共纯化方式的优化，最后确定了一种适合目的蛋白的可减少降解且顺利纯化的方法。对探究m7G46修饰的致癌机制研究和开发靶向药物的关键技术奠定了分子学和结构学基础。
附图说明
[0010]图1为降低蛋白降解实验方案流程图。
[0011]图2为目的蛋白基因PCR后琼脂糖凝胶电泳胶图。
[0012]图3为目的蛋白与载体酶切后琼脂糖凝胶电泳胶图。
[0013]图4为成功克隆的酶切验证琼脂糖凝胶电泳胶图。
[0014]图5为METTL1
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Full蛋白在PET.28a中纯化蛋白的考马斯亮蓝胶图。
[0015]图6为METTL1
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Full蛋白在PET.32M.3C中纯化蛋白的考马斯亮蓝胶图。
[0016]图7为METTL1
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Con蛋白在PET.32M.3C中纯化蛋白的考马斯亮蓝胶图。
[0017]图8为METTL1
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Con与WDR4在PET.32M.3C中共纯化的考马斯亮蓝胶图。
[0018]图9为METTL1
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Con与WDR4
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Con共转化到大肠杆菌后进行纯化的考马本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种METTL1和WDR4蛋白复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、在NCBI中查找出METTL1和WDR4的全长基因信息，进行化学合成，设计引物通过PCR反应去掉降解片段，分别获得METTL1
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Con基因片段与WDR4
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Con基因片段；S2、首先，将步骤S1获得的基因片段分别以25 uL体系进行PCR反应，反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，对PCR成功的基因片段进行胶回收，分别获得METTL1
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Con目的片段与WDR4
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Con目的片段；然后将METTL1
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Con目的片段、WDR4
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Con目的片段、PET.32M.3C目的载体与PET.28a目的载体共同进行酶切实验，并再次进行琼脂糖凝胶电泳和胶回收；S3、将胶回收后的METTL1
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Con目的片段与PET.32M.3C载体、WDR4
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Con目的片段与PET.28a载体分别在16 ℃进行连接并转化进入大肠杆菌DH5a中，对转化成功的目的片段进行双酶切验证，验证成功后进行质粒测序分析，保证目的基因完全正确无突变；S4、将S3中测序成功的质粒共同转化到大肠杆菌BL21中表达；S5、将含METTL1
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Con与WDR4
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Con双质粒的大肠杆菌在含有A
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和K
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双抗性的LB中培养，并用IPTG诱导16 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵蓉，王德平，周鑫，王美月，曹济民，侯佳宜，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：