一种腺苷人工抗原、腺苷抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，本发明专利技术公开了一种腺苷人工抗原、腺苷抗体及其应用。本发明专利技术在腺苷的4

【技术实现步骤摘要】
一种腺苷人工抗原、腺苷抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种腺苷人工抗原、腺苷抗体及其应用。

技术介绍

[0002]腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷。作为维持稳态和调节免疫反应的重要信号分子，腺苷的生成、降解及运输受到机体的严格调控。当组织出现炎症、缺血、低氧等病理生理情况时，多种机制可导致细胞内的ATP大量释放到细胞外，经胞外核苷酸酶(以CD39和CD73作用最为显著)的逐级去磷酸化，引起腺苷浓度急剧上升。不同于ATP具有的免疫刺激能力，腺苷对免疫反应有显著的抑制作用，以避免组织的过度伤害。高浓度的腺苷则主要通过磷酸化形成一磷酸腺苷或通过腺苷脱氨酶形成肌苷而清除，恢复并维持其在较低的正常水平。
[0003]近年来腺苷信号通路在肿瘤免疫逃逸和免疫治疗耐受中的作用机制受到广泛研究。在肿瘤的发生发展过程中，低氧诱导的HIF
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1α可促进细胞表面CD39和CD73的广泛高表达，进而使肿瘤细胞高代谢产生的大量ATP转化为重要的免疫抑制因子腺苷，后者不仅可以招募Treg、MDSC、CAF等免疫抑制细胞，还可与A2AR受体直接结合来抑制NK细胞、树突状细胞、细胞毒性T细胞等免疫细胞的活性，形成有利于肿瘤生长的免疫抑制性肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)。
[0004]目前已有多种靶向CD39
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CD73
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A2AR通路的小分子抑制剂或单克隆抗体，但研究发现另有CD38催化NAD+生成的ADPR/cADPR(环腺苷二磷酸核糖)可继续在CD203、CD73等酶的作用下生成腺苷，因此获得直接靶向结合异常高水平腺苷的物质可能是一个改善免疫抑制性TME的重要策略。抗体因其具有蛋白质的天然特性和高度特异性的优点，在靶向疾病治疗中得到了广泛应用。腺苷的分子量仅为267.24，其相应抗体作为大分子物质(IgG相对分子量约150,000)仅需微量体积就可完全阻断腺苷与受体的结合，抑制腺苷的生物学活性。同时在检测方面，目前国内外分析腺苷主要采用气相色谱法、气相色谱
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质谱法和液相色谱串联质谱法等，存在样品处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，相比之下，操作简便、快速、高灵敏度的免疫学检测技术具有诸多优势。因此制备出靶向腺苷的抗体具有广阔的应用前景和临床转化价值。
[0005]不同于大分子抗原物质，腺苷的分子结构简单，作为半抗原不足以激发充分的免疫反应，因而实现制备腺苷抗体这一目标的关键就在于设计并合成出合适的腺苷人工抗原，但是现有技术中尚无有关于腺苷人工抗原及抗体的相关报道。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种腺苷人工抗原、腺苷抗体及其应用。本专利技术在腺苷的4
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氨基上或在腺苷的9
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呋喃核糖基氧化产生的甲醛基上通过酰胺反应或醛胺反应偶联载体蛋白。利用上述制备的具有免疫原性的腺苷人工抗原免疫动物，可以产生与腺苷特异性结合的抗体。其中公开了一种单克隆抗体的重链和轻链可变区的CDR区氨基
酸序列，经验证该抗体与其他腺苷类似物的交叉反应率低，为后续有关腺苷的检测和治疗提供了基础，具有广阔的应用前景。
[0007]本专利技术的具体技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种腺苷人工抗原，结构式如式(I)或式(II)所示：本专利技术的腺苷人工抗原是在最小程度改变腺苷分子原有结构的基础上获得的，其保留了腺苷的主要结构，具有出色的免疫原性，能够刺激免疫细胞活化、增殖与分化，产生具有免疫效应的抗体。
[0008]第二方面，本专利技术提供了上述腺苷人工抗原的制备方法，在腺苷的4
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氨基上通过酰胺反应偶联载体蛋白(获得式(I))，或在腺苷的9
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呋喃核糖基氧化产生的甲醛基上通过醛胺反应偶联载体蛋白(获得式(II))。其中，上述酰胺反应发生于载体蛋白的
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COOH，醛胺反应发生于载体蛋白的
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NH2。
[0009]通过本专利技术的上述制备方法，可使腺苷的特征基团暴露于载体蛋白表面而不被覆盖，这些特征基团作为抗原决定簇，可有效刺激机体产生免疫反应。
[0010]作为优选，所述酰胺反应使用EDC或EDC/NHS偶联法。
[0011]作为优选，所述甲醛基使用高碘酸钠氧化生成。
[0012]作为优选，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、乳铁蛋白、鸡卵白蛋白或猪甲状腺球蛋白。
[0013]第三方面，本专利技术提供了一种腺苷抗体，由上述腺苷人工抗原免疫动物获得。
[0014]作为优选，抗体的制备方法具体为将上述任一种腺苷人工抗原与免疫佐剂混匀后免疫动物，获得杂交瘤细胞，收集培养上清，进行筛选、鉴定与纯化。
[0015]作为优选，所述抗体为单克隆抗体，其重链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的CDR1、SEQ ID NO：2所示的CDR2和SEQ ID NO：3所示的CDR3；其轻链可变区包含氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的CDR1、SEQ ID NO：5所示的CDR2和SEQ ID NO：6所示的CDR3。
[0016]本专利技术的上述腺苷单克隆抗体具有高亲和力，其Ka值大于3.0
×
10
10
M，且能够特异
性地优先结合游离的腺苷，与AMP和腺嘌呤的交叉反应率低于25％。
[0017]第四方面，本专利技术提供了上述腺苷抗体在制备用于中和局部或全身游离腺苷的药物中的应用。
[0018]进一步地，所述药物用于恶性肿瘤或微环境中腺苷浓度异常升高的相关疾病。
[0019]作为优选，所述恶性肿瘤主要为结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌和人高侵袭性恶性黑色素瘤。
[0020]第五方面，本专利技术提供了上述腺苷抗体在制备用于测定样本腺苷水平的试剂或试剂盒中的应用。
[0021]进一步地，所述试剂或试剂盒为腺苷ELISA试剂盒、腺苷胶体金试纸条或腺苷胶乳微球偶联物。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：(1)本专利技术提供的腺苷人工抗原，最小程度地改变了腺苷分子的原有结构，具有出色的免疫原性，能够刺激免疫细胞活化、增殖与分化，产生具有免疫效应的抗体。
[0023](2)本专利技术提供的腺苷人工抗原制备方法，利用腺苷4号位的氨基或9号位呋喃核糖基氧化产生的醛基进行偶联，操作过程简单方便，反应条件易于控制；且通过该制备方法可使腺苷的特征基团暴露于载体蛋白表面而不被覆盖，这些特征基团作为抗原决定簇，可有效刺激机体产生免疫反应。
[0024](3)采用本专利技术腺苷人工抗原制备的腺苷抗体，具有高亲和力和特异性，其与腺苷类似物AMP和腺嘌呤的交叉反应率低。
[0025](4)本专利技术解决了目前尚无靶向腺苷的抗体的技术问题，其中抗体的分子量远大于腺苷，仅需微量体积就能结合游离的腺苷，在对微环境中腺苷浓度异常升高的肿瘤或其他疾病的检测与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腺苷人工抗原，其特征在于：结构式如式(I)或式(II)所示：2.如权利要求1所述的腺苷人工抗原，其特征在于：结构式如式(I)所示的腺苷人工抗原，由在腺苷的4
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氨基上通过酰胺反应偶联载体蛋白后获得。3.如权利要求1所述的腺苷人工抗原，其特征在于：结构式如式(II)所示的腺苷人工抗原，由在腺苷的9
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呋喃核糖基氧化产生的甲醛基上通过醛胺反应偶联载体蛋白后获得。4.如权利要求2或3所述的腺苷人工抗原，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、乳铁蛋白、鸡卵白蛋白或猪甲状腺球蛋白。5.如权利要求1
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4之一所述腺苷人工抗原在制备腺苷抗体中的应用。6.一种腺苷抗体，其特征在于：所述腺...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱永良，汪睿，余琳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：