制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法技术

技术编号：35730858 阅读：35 留言：0更新日期：2022-11-26 18:30

本披露提供了制备免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的方法以及通过此类方法生成的组合物，这些免疫效应细胞包含(i)编码可控嵌合抗原受体(CCAR)的核酸分子或(ii)编码CAR和调节分子的核酸分子。节分子的核酸分子。

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【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2020年2月27日提交的美国临时申请62/982,698的优先权，该申请的全部内容通过引用特此并入。
[0003]序列表
[0004]本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且将该序列表通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2021年2月19日，名为N2067
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7169WO_SL.txt，大小为386,964字节。

[0005]本披露总体上涉及制备经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法，以及包含这些免疫效应细胞的组合物。

技术介绍

[0006]使用T细胞(特别是用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞)的过继性细胞转移(ACT)疗法在几项血液癌症试验中显示出前景。目前，基因修饰的T细胞的制造是一个复杂的过程。存在对改善表达CAR的细胞疗法产品的产生、提高产品质量和使产品的治疗功效最大化的方法和程序的需求。

技术实现思路

[0007]本披露关于制备经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的方法，以及使用此类方法生成的组合物。还披露了使用此类组合物用于治疗受试者的疾病(例如癌症)的方法。
[0008]在一些实施例中，本披露的特征在于制备细胞(例如，T细胞)群体的方法，该细胞群体包含：编码可控嵌合抗原受体(CCAR)的第一核酸分子，或编码嵌合抗原受体(CAR)和调节分子的第二核酸分子。在一些实...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备细胞(例如T细胞)群体的方法，所述细胞群体包含：编码可控嵌合抗原受体(CCAR)的第一核酸分子，或编码嵌合抗原受体(CAR)和调节分子的第二核酸分子，所述方法包括：(i)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻的或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触(例如结合)；(ii)使所述细胞(例如T细胞)群体与编码CCAR的第一核酸分子(例如DNA或RNA分子)或编码CAR和调节分子的第二核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含所述第一或第二核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，以及(iii)收获所述细胞(例如T细胞)群体，以用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制所述细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(ii)与步骤(i)一起进行或在步骤(i)开始后不晚于20小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时进行，并且步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于30(例如26)小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于24小时进行，(b)步骤(ii)与步骤(i)一起进行或在步骤(i)开始后不晚于20小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时进行，例如在步骤(i)开始后不晚于18小时进行，并且步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时进行，例如在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时进行，或(c)例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％；任选地其中步骤(ii)中的所述第一或第二核酸分子在病毒载体上，任选地其中步骤(ii)中的所述第一或第二核酸分子是病毒载体上的RNA分子，任选地其中步骤(ii)包括用包含所述第一或第二核酸分子的病毒载体转导所述细胞(例如T细胞)群体。2.如权利要求1所述的方法，其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂(例如抗CD3抗体)，并且其中所述刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4
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1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂或所述刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂或所述刺激共刺激分子的药剂不包含珠；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂包含抗CD3抗体，并且所述刺激共刺激分子的药剂包含抗CD28抗体；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD3抗体，并且所述刺激共刺激分子的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD28抗体；任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂和所述刺激共刺激分子的药剂包含T细胞TransAct
TM
。3.如权利要求1或2所述的方法，其中与通过除不包括步骤(i)外其他方面类似的方法
制备的细胞相比，步骤(i)增加来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的细胞的百分比，例如，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的包含所述第一或第二核酸分子的细胞(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、或60％更高)。4.如权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中(a)来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+细胞的百分比相同或相差不超过5％或10％；(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞的百分比增加例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍；(c)所述细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的初始T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞的百分比在步骤(ii)的持续时间期间增加，例如在步骤(ii)开始后的18
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24小时之间增加例如至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％；或(d)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞的百分比不降低，或降低不超过5％或10％。5.如权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中(a)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)；(b)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍更高)；(c)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的初始T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的初始T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞的百分比更高(例如至少4、6、8、10、或12倍更高)；(d)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)；(e)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T
细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
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CCR7+T细胞的百分比更高(例如至少1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、或3倍更高)；或(f)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的初始T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的初始T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD45RO
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CCR7+ T细胞的百分比更高(例如至少4、6、8、10、或12倍更高)。6.如权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中(a)来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞的百分比与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞的百分比相同或相差不超过5％或10％；(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％；(c)包含所述第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+细胞的百分比在步骤(ii)的持续时间期间降低，例如在步骤(ii)开始后的18
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24小时之间降低例如至少8％、10％、12％、14％、16％、18％、或20％；或(d)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比不增加或增加不超过5％或10％。7.如权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中(a)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)；(b)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比更低(例如至少20％、30％、40％、或50％更低)；(c)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比更低(例如至少
10％、20％、30％或40％更低)；(d)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体显示出更低百分比的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CD95+中枢记忆T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更低)；(e)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如中枢记忆T细胞，例如CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比更低(例如至少20％、30％、40％、或50％更低)；或(f)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的中枢记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CCR7+CD45RO+ T细胞的百分比更低(例如至少10％、20％、30％或40％更低)。8.如权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中(a)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比增加；(b)如与在步骤(i)开始时细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比增加；(c)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高；或(d)与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高；(e)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)
细胞群体中的干细胞记忆T细胞，例如CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高；或(f)与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比相比，来自步骤(iii)的细胞群体中的包含所述第一或第二核酸分子的干细胞记忆T细胞，例如包含所述第一或第二核酸分子的CD45RA+CD95+IL
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2受体β+CCR7+CD62L+ T细胞的百分比更高。9.如权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中(a)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、75％、100％、或125％；(b)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)与以下的中位数基因集评分(向上TEM对比向下TSCM)相比更低(例如，至少低约100％、150％、200％、250％、或300％)：通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞；(c)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、或200％；(d)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)与以下的中位数基因集评分(向上Treg对比向下Teff)相比更低(例如，至少低约50％、100％、125％、150％、或175％)：通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞；(e)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约25％、50％、100％、150％、200％、或250％；(f)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向下干细胞性)与以下的中位数基因集评分(向下干细胞性)相比更低(例如，至少低约50％、100％、或125％)：通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞；(g)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与来自步骤(i)开始时
细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约125％、150％、175％、或200％；(h)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上缺氧)与以下的中位数基因集评分(向上缺氧)相比更低(例如，至少低约40％、50％、60％、70％、或80％)：通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞；(j)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与来自步骤(i)开始时细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)大约相同或相差不超过(例如，增加不超过)约180％、190％、200％、或210％；或(k)来自步骤(iii)的细胞群体的中位数基因集评分(向上自噬)与以下的中位数基因集评分(向上自噬)相比更低(例如，至少低约20％、30％、或40％)：通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞，或通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞。10.如权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中例如，如使用实例8中结合图29C
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29D描述的方法进行评估，与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比；或与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在与表达由CCAR或CAR识别的抗原的细胞一起孵育后，以更高的水平(例如至少2、4、6、8、10、12、或14倍更高)分泌IL
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2。11.如权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比；或与通过除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。12.如权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中与通过除步骤(iii)在步骤(i)开始后超过26小时进行，例如在步骤(i)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比；或与除进一步包括在步骤(ii)之后和在步骤(iii)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(iii)的细胞群体在经体内施用后显示出更强的抗肿瘤活性(例如在低剂量下具有更强的抗肿瘤活性，例如不超过0.15x106、0.2x106、0.25x106、或0.3x106个包含所述第一或第二核酸分子的活细胞的剂量)。13.如权利要求1
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12中任一项所述的方法，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、
15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％，任选地其中来自步骤(iii)的细胞群体中的活细胞数目较步骤(i)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。14.如权利要求1
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13中任一项所述的方法，其中与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增少于2小时，例如少于1或1.5小时。15.如权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在包含IL
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2、IL
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15(例如hetIL
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15(IL15/sIL
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15Ra))、IL
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7、IL
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21、IL
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6(例如IL
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6/sIL
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6Ra)、LSD1抑制剂、MALT1抑制剂、或其组合的细胞培养基(例如无血清培养基)中进行。16.如权利要求1
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15中任一项所述的方法，其中步骤(i)和/或(ii)在包含血清替代物的无血清细胞培养基中进行。17.如权利要求16所述的方法，其中所述血清替代物是CTS
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免疫细胞血清替代物(ICSR)。18.如权利要求1
‑
17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)(任选地)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的新鲜的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如新鲜的全血产物、新鲜的骨髓产物、或新鲜的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜的产物))，以及(v)从新鲜的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如新鲜的全血产物、新鲜的骨髓产物、或新鲜的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的新鲜的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+ T细胞)群体，任选地其中：步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时进行，或例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。19.如权利要求1
‑
17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(i)之前：接受从来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，如从全血、骨髓、或肿瘤或器官活检物或摘除物(例如胸腺切除术)中分离的冷冻保存的T细胞)中分离的冷冻保存的T细胞。20.如权利要求1
‑
17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(i)之前：(iv)(任选地)接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))，以及(v)从冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))中分离在步骤(i)中接触的细胞(例如T细胞，例如CD8+和/或CD4+ T细胞)群体，任选地其中：步骤(iii)在步骤(v)开始后不晚于35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于27、28、29、30、31、32、33、34、或35小时进行，例如在步骤(v)开始后不晚于30小时进行，或例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(v)结束时的细胞群体相比，来自步骤(iii)
的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。21.如权利要求1
‑
20中任一项所述的方法，所述方法进一步包括步骤(vi)：将来自步骤(iii)的细胞群体的一部分培养至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超过7天，并且测量所述部分中的CAR(例如CCAR)表达水平(例如测量所述部分中活的表达CAR的细胞(例如表达CCAR的细胞)的百分比)，任选地其中：步骤(iii)包括收获和冷冻所述细胞(例如T细胞)群体，并且步骤(vi)包括将来自步骤(iii)的细胞群体的一部分解冻，将所述部分培养至少2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、或7天，例如至少2天且不超过7天，并且测量所述部分中的CAR(例如CCAR)表达水平(例如测量所述部分中活的表达CAR的细胞(例如表达CCAR的细胞)的百分比)。22.一种制备细胞(例如T细胞)群体的方法，所述细胞群体包含：编码可控嵌合抗原受体(CCAR)的第一核酸分子，或编码嵌合抗原受体(CAR)和调节分子的第二核酸分子，所述方法包括：(1)使细胞(例如T细胞，例如从冷冻的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与细胞因子接触，所述细胞因子选自IL
‑
2、IL
‑
7、IL
‑
15、IL
‑
21、IL
‑
6，或其组合；(2)使所述细胞(例如T细胞)群体与编码CCAR的第一核酸分子(例如DNA或RNA分子)或编码CAR和调节分子的第二核酸分子(例如DNA或RNA分子)接触，从而提供包含所述第一或第二核酸分子的细胞(例如T细胞)群体，以及(3)收获所述细胞(例如T细胞)群体，以用于储存(例如在冷冻保存培养基中重新配制所述细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(2)与步骤(1)一起进行或在步骤(1)开始后不晚于5小时进行，例如在步骤(1)开始后不晚于1、2、3、4、或5小时进行，并且步骤(3)在步骤(1)开始后不晚于26小时进行，例如在步骤(1)开始后不晚于22、23、或24小时进行，例如在步骤(1)开始后不晚于24小时进行，或(b)例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％；任选地其中步骤(2)中的所述第一或第二核酸分子在病毒载体上，任选地其中步骤(ii)中的所述第一或第二核酸分子是病毒载体上的RNA分子，任选地其中步骤(ii)包括用包含所述第一或第二核酸分子的病毒载体转导所述细胞(例如T细胞)群体。23.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL
‑
2接触。24.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL
‑
7接触。25.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL
‑
15(例如hetIL
‑
15(IL15/sIL
‑
15Ra))接触。26.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL
‑
21接触。
27.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL
‑
6(例如IL
‑
6/sIL
‑
6Ra)接触。28.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL
‑
7和IL
‑
15(例如hetIL
‑
15(IL15/sIL
‑
15Ra))接触。29.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL
‑
7和IL
‑
21接触。30.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL
‑
15(例如hetIL
‑
15(IL15/sIL
‑
15Ra))和IL
‑
21接触。31.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL
‑
7、IL
‑
15(例如hetIL
‑
15(IL15/sIL
‑
15Ra))、和IL
‑
21接触。32.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL
‑
6(例如IL
‑
6/sIL
‑
6Ra)和IL
‑
15(例如hetIL
‑
15(IL15/sIL
‑
15Ra))接触。33.如权利要求22所述的方法，其中步骤(1)包括使所述细胞(例如T细胞)群体与IL
‑
2和IL
‑
6(例如IL
‑
6/sIL
‑
6Ra)接触。34.如权利要求22
‑
33中任一项所述的方法，其中与通过除进一步包括使细胞群体与例如抗CD3抗体接触外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出在包含所述第一或第二核酸分子的细胞中更高百分比的初始细胞(例如至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％更高)。35.如权利要求22
‑
34中任一项所述的方法，其中来自步骤(3)细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
‑
CCR7+T细胞的百分比：(a)与在步骤(1)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
‑
CCR7+细胞的百分比相同或相差不超过5％或10％，或(b)如与在步骤(1)开始时细胞群体中的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
‑
CCR7+细胞的百分比相比增加，例如增加至少10％或20％。36.如权利要求22
‑
35中任一项所述的方法，其中与通过除步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时进行，例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
‑
CCR7+ T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)。37.如权利要求22
‑
36中任一项所述的方法，其中与通过除进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体显示出更高百分比的初始细胞，例如初始T细胞，例如CD45RA+CD45RO
‑
CCR7+ T细胞(例如至少10％、20％、30％、或40％更高)。38.如权利要求22
‑
37中任一项所述的方法，其中与通过除步骤(3)在步骤(1)开始后超过26小时进行，例如在步骤(1)开始后超过5、6、7、8、9、10、11、或12天进行外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或以更高的水平扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。39.如权利要求22
‑
38中任一项所述的方法，其中与通过除进一步包括在步骤(2)之后和在步骤(3)之前在体外扩增细胞(例如T细胞)群体超过3天，例如5、6、7、8、或9天外其他方面类似的方法制备的细胞相比，来自步骤(3)的细胞群体在经体内施用后持续更长时间或
以更高的水平扩增(例如，如使用实例1中结合图4C描述的方法进行评估)。40.如权利要求22
‑
39中任一项所述的方法，例如，如通过活细胞数目进行评估，与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％，任选地其中来自步骤(3)细胞群体中的活细胞数目较步骤(1)开始时细胞群体中的活细胞数目减少。41.如权利要求22
‑
40中任一项所述的方法，其中与步骤(1)开始时的细胞群体相比，来自步骤(3)的细胞群体不扩增或扩增少于2小时，例如少于1或1.5小时。42.如权利要求22
‑
41中任一项所述的方法，其中所述细胞群体在体外不与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂接触，或如果进行接触，接触步骤少于2小时，例如不超过1小时或1.5小时。43.如权利要求42所述的方法，其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂(例如抗CD3抗体)，并且其中所述刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4
‑
1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂，任选地其中所述刺激CD3/TCR复合物的药剂或所述刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如单结构域抗体(例如重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。44.如权利要求22
‑
43中任一项所述的方法，其中步骤(1)和/或(2)在细胞培养基中进行，所述细胞培养基包含：不超过5％、4％、3％、2％、1％、或0％血清，任选地其中步骤(1)和/或(2)在细胞培养基中进行，所述细胞培养基包含约2％血清、或LSD1抑制剂或MALT1抑制剂。45.如权利要求22
‑
44中任一项所述的方法，所述方法进一步包括接受来自实体，例如实验室、医院或医疗保健提供者的冷冻保存的白细胞单采产物(或造血组织的替代性来源，例如冷冻保存的全血产物、冷冻保存的骨髓产物、或冷冻保存的肿瘤或器官活检物或摘除物(例如来自胸腺切除术的冷冻保存的产物))。46.如权利要求1
‑
45中任一项所述的方法，其中在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体已经富集了表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。47.如权利要求1
‑
46中任一项所述的方法，其中在步骤(i)或步骤(1)开始时的细胞群体包含不少于50％、60％、或70％的表达IL6R的细胞(例如对IL6Rα和/或IL6Rβ呈阳性的细胞)。48.如权利要求1
‑
47中任一项所述的方法，其中步骤(i)和(ii)或步骤(1)和(2)在包含IL
‑
15(例如hetIL
‑
15(IL15/sIL
‑
15Ra))的细胞培养基中进行。49.如权利要求48所述的方法，其中例如10、15、20、或25天后，IL
‑
15增加所述细胞群体扩增的能力。50.如权利要求48所述的方法，其中IL
‑
15增加所述细胞群体中表达IL6Rβ的细胞的百分比。51.如权利要求1
‑
50中任一项所述的方法，其中所述CCAR或CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和/或细胞内信号传导结构域。52.如权利要求51所述的方法，其中所述抗原结合结构域与选自以下的抗原结合：
CD19、CD20、CD22、BCMA、间皮素、EGFRvIII、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn
‑
O
‑
糖肽、sTn
‑
O
‑
糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL
‑
13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL
‑
11Ra、PSCA、MAD
‑
CT
‑
1、MAD
‑
CT
‑
2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR
‑
β、SSEA
‑
4、叶酸受体α、ERBB(例如ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、邻乙酰基
‑
GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML
‑
IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、多唾液酸、Fos相关抗原、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP
‑
2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN
‑
CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp 70
‑
2、NA
‑
17、NY
‑
BR
‑
1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY
‑
ESO
‑
1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4、或MHC上呈递的这些抗原中的任一个的肽。53.如权利要求51或52所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含本文披露的CDR、VH、VL或scFv序列，任选地其中：(a)所述抗原结合结构域与BCMA结合，并且包含表3
‑
15中披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；(b)所述抗原结合结构域与CD19结合，并且包含表2中披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；(c)所述抗原结合结构域与CD20结合，并且包含本文披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列；或(d)所述抗原结合结构域与CD22结合，并且包含本文披露的CDR、VH、VL、scFv或CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、或99％同一性的序列。54.如权利要求51
‑
53中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域包含VH和VL，其中所述VH和VL通过接头连接，任选地其中所述接头包含SEQ ID NO:63或104的氨基酸序列。55.如权利要求51
‑
54中任一项所述的方法，其中(a)所述跨膜结构域包含选自T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154的蛋白质的跨膜结构域；(b)所述跨膜结构域包含CD8的跨膜结构域；(c)所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或(d)所述第一或第二核酸分子包含编码所述跨膜结构域的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:17的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。56.如权利要求51
‑
55中任一项所述的方法，其中所述抗原结合结构域通过铰链区与所述跨膜结构域连接，任选地其中：(a)所述铰链区包含SEQ ID NO:2、3、或4的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或(b)所述第一或第二核酸分子包含编码所述铰链区的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:13、14、或15的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。57.如权利要求51
‑
56中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含初级
信号传导结构域，任选地其中所述初级信号传导结构域包含源自CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FcεRI、DAP10、DAP12、或CD66d的功能性信号传导结构域，任选地其中：(a)所述初级信号传导结构域包含源自CD3ζ的功能性信号传导结构域；(b)所述初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的氨基酸序列，或(c)所述第一或第二核酸分子包含编码所述初级信号传导结构域的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO:20或21的核酸序列，或与其具有至少约85％、90％、95％、或99％序列同一性的核酸序列。58.如权利要求51
‑
57中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域，任选地其中所述共刺激信号传导结构域包含源自MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、激活性NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM
‑
1、4
‑
1BB(CD137)、B7
‑
H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA
‑
6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA
‑
1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB
‑
A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO
‑
3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP
...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：

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