一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法技术

本发明专利技术提供一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法，包括以下主要步骤：一、间充质干细胞的培养；二、细胞上清预处理；三、超滤管浓缩；四、SEC纯化；五、超滤管再次浓缩。本方法以间充质干细胞上清作为提取目标，可以得到形态均匀、纯度较高的外泌体。整个过程无需超速离心机，解决了超速离心难的问题，制备条件温和，得到的外泌体完整性有保障；耗时短，分离纯化时间只需要15分钟；操作简便，无需特殊设备；重复性好，且纯度高；缓冲液体系，对下游实验无干扰等优点。本方法优势在于可解决工业化外泌体的提取，方便下游的各种外泌体研究和临床医学使用。和临床医学使用。和临床医学使用。

【技术实现步骤摘要】
一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法


[0001]本专利技术涉及外泌体制备领域，具体为一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法。

技术介绍

[0002]外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，近年来对外泌体递送药物研究越来越频繁，外泌体递送药物到指定的细胞对医学领域起到重要的研究意义，常规的提取方式有密度梯度离心、差速离心、SEC、亲和纯化等，虽然差速离心是提取金标准，但是提取步骤需要4
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5步，十分耗时，不可扩展，且多次离心不仅会降低得率也会破坏外泌体的完整性。以上所述，现有技术中的外泌体提取工艺提取效率低，且难以保证具有高纯度和高浓度的效果。

技术实现思路

[0003]针对现有技术存在的不足，本专利技术目的是提供一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题,本专利技术减少了外泌体提取的时间，提取的纯度和浓度更高，设备需求低。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法，该方法包括如下步骤：
[0005](1)间充质干细胞培养：间充质干细胞提取后，用间充质干细胞无血清培养基将细胞置于37℃，5％CO2条件下培养。
[0006](2)细胞上清预处理：将待提取的外泌体样本经过离心除去大颗粒杂质。样本离心为3000
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10000g，4℃离心15
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20min，弃沉淀，留取上清1
>‑
50ml。
[0007](3)超滤管浓缩：超滤管离心对样本进行浓缩的同时去除杂蛋白。样本放入超滤管后设置离心力为3500g，4℃离心20
‑
30min，留取截留上清1
‑
50ml。
[0008](4)SEC纯化：样本过SEC分子筛层析柱中，收集外泌体馏分。排空SEC柱内缓冲液后，加入样本，待样本完全进去柱内，加入等体积(1
‑
5ml)生理盐水，开始接馏分。重复加入等体积生理盐水，接取对应馏分(1
‑
5ml)。
[0009](5)超滤管再次浓缩：收集馏分再次用超滤管离心浓缩得到高纯度，高浓度外泌体。将含有外泌体的馏分混合后(1
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15ml)，用超滤管再次离心浓缩得到外泌体(200ul
‑
5ml)。
[0010]进一步的，所述间充质干细胞置于37℃，5％CO2条件下，利用无血清培养培养，传至6
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8代。
[0011]进一步的，使用的离心机可调节温度为4℃，离心力可达到3500
‑
10000g。
[0012]进一步的，膜尺寸在30
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500KD，可有效截取外泌体。
[0013]进一步的，SEC柱体积12
‑
60ml。
[0014]进一步的，所述间充质干细胞包括分离原代间充质干细胞，并细胞达到一定融合
度，在超净台中，弃去T
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25瓶中的培养液，加入适量的DPBS清洗细胞后，弃去，再加入1mL干细胞温和消化酶消化细胞，消化时间2～5min。
[0015]进一步的，在镜下观察到细胞状态合格后加入细胞培养上清或完全培养基稀释细胞悬液。用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。
[0016]进一步的，将细胞悬液转移到15mL离心管中，离心弃上清，加入适量无血清培养基，重悬细胞后接入新的培养瓶中，确保细胞均匀分布。
[0017]进一步的，分离原代间充质干细胞通过采用植块法或酶消化法，所述EC柱料直径26.6mm，柱高134.8mm，填料高100mm。SEC层析柱上样量为5ml细胞上清，SEC层析柱洗脱液为生理盐水。SEC层析柱收集馏分2
‑
5，共收集体积为20ml。
[0018]进一步的，细胞融和度达80％，弃培养基，所述细胞状态在镜下观察到细胞全部收缩变圆，且有少量细胞开始流动时，即为合格状态，此时立即加入温和酶使用量2倍体积(2mL)的细胞培养上清或完全培养基稀释细胞悬液。
[0019]本专利技术的有益效果：
[0020]1.该GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法可以得到优于市面纯度的外泌体，条件温和，得到的外泌体完整性有保障。
[0021]2.该GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法耗时短，分离纯化时间只需要15分钟；操作简便，无需特殊设备。
[0022]3.该GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法重复性好，且纯度高；缓冲液体系，对下游实验无干扰等优点。同时能够解决工业化外泌体的提取，方便下游的各种外泌体研究和临床医学使用。
附图说明
[0023]图1为本专利技术一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法的外形的流程图；
[0024]图2为本专利技术中SEC纯化细胞上清外泌体馏分BCA蛋白鉴定；
[0025]图3为本专利技术中最后超滤浓缩细胞上清得到外泌体WB鉴定；
[0026]图4为本专利技术中最后超滤浓缩细胞上清得到外泌体NTA鉴定；
[0027]图5为本专利技术中最后超滤浓缩细胞上清得到外泌体电镜鉴定。
具体实施方式
[0028]为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。
[0029]请参阅图1至图5，本专利技术提供一种技术方案：一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法，包括以下主要步骤：一、间充质干细胞的培养；二、细胞上清预处理；三、超滤管浓缩；四、SEC纯化；五、超滤管再次浓缩，具体的，酶消化法分离原代间充质干细胞。待细胞融和度达80％，在超净台中，弃去T
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25瓶中的培养液，加入适量的DPBS清洗细胞后，弃去，再加入1mL干细胞温和消化酶消化细胞，消化时间2～5min。在镜下观察到细胞全部收缩变圆，且有少量细胞开始流动时，立即加入温和酶使用量2倍体积(2mL)的细胞培养上清或完全培养基稀释细胞悬液。用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混
匀，使细胞完全分散。将细胞悬液转移到15mL离心管中，1300rpm(300g)离心5min，弃上清，加入适量无血清培养基。重悬细胞后接入新的培养瓶中，确保细胞均匀分布，细胞密度达到为8000cells/cm2。
[0030]本实施例，将细胞置于37℃，5％CO2条件下，无血清培养基培养并传代至第6代。收集间充质干细胞上清2
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6代，离心条件为10000g，4℃离心30min。留上清，弃沉淀。上清用于后续外泌体提取。将离心后的上清转入超滤管中，3500g，4℃离心20min，取截留液体。取截留浓缩液5mL加入SEC预装柱，预装柱高度为100mm，上样开始后进行馏分的收集，总共收集1
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10号馏分。馏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：(1)间充质干细胞培养：间充质干细胞提取后，用间充质干细胞无血清培养基将细胞置于37℃，5％CO2条件下培养。(2)细胞上清预处理：将待提取的外泌体样本经过离心除去大颗粒杂质。样本离心为3000
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10000g，4℃离心15
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20min，弃沉淀，留取上清1
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50ml。(3)超滤管浓缩：超滤管离心对样本进行浓缩的同时去除杂蛋白。样本放入超滤管后设置离心力为3500g，4℃离心20
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30min，留取截留上清1
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50ml。(4)SEC纯化：样本过SEC分子筛层析柱中，收集外泌体馏分。排空SEC柱内缓冲液后，加入样本，待样本完全进去柱内，加入等体积(1
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5ml)生理盐水，开始接馏分。重复加入等体积生理盐水，接取对应馏分(1
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5ml)。(5)超滤管再次浓缩：收集馏分再次用超滤管离心浓缩得到高纯度，高浓度外泌体。将含有外泌体的馏分混合后(1
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15ml)，用超滤管再次离心浓缩得到外泌体(200ul
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5ml)。2.根据权利要求1所述的一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞置于37℃，5％CO2条件下，利用无血清培养培养，传至6
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8代。3.根据权利要求1所述的一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法，其特征在于：使用的离心机可调节温度为4℃，离心力可达到3500
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10000g。4.根据权利要求3所述的一种GMP车间从间充质干细胞上清提取外泌体制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李立，吴笛笛，刘丕菊，甘宁，张静，袁敏，
申请(专利权)人：多莱泌生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：