用于基因组测试测定的高性能荧光成像模块制造技术

描述了荧光成像系统设计，其提供更大的视场、更高的空间分辨率、改善的调制传递和图像质量、更高的空间采样频率、重新定位样品平面以捕获一系列图像(例如，不同视场)时图像捕获之间的更快过渡、以及改善的成像系统占空比，因此使得能够为基因组学和其他成像应用提供更高通量的图像获取和分析。更高通量的图像获取和分析。更高通量的图像获取和分析。

【技术实现步骤摘要】
用于基因组测试测定的高性能荧光成像模块
本申请是申请日为2021年01月15日、申请号为202180003305.6、专利技术名称为“用于基因组测试测定的高性能荧光成像模块”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2021年01月15日、申请号为PCT/US2021/013696)的分案申请。交叉引用
[0001]本申请要求2020年9月9日提交的美国临时申请第63/076,361号和2020年1月17日提交的美国临时申请第62/962,723号的权益，通过引用而将它们整体并入本文。

技术介绍

[0002]在典型的基于荧光的基因组测试测定，例如，基因分型或核酸测序(使用实时、循环或步进反应方案)中，使用激发光源激发与拴系在基质上的核酸分子相连接的染料分子，在基质上一个或多个空间定位的位置产生荧光光子信号，并且随后使荧光通过光学系统成像到图像传感器上。然后使用分析方法来分析图像，找到基质上经标记的分子(或分子的克隆扩增簇)的位置，并根据波长和空间坐标对荧光光子信号进行量化，然后可以将其与在基质上指定位置发生的特定化学反应(例如，杂交事件或碱基添加事件)的程度相关联。基于图像的方法提供了大规模并行和多路复用能力，这有助于降低此类技术的成本和可得性。但是，由于例如基质表面小区域内的经标记的分子(或分子的克隆扩增簇)的过密堆积或由于图像中的低对比度噪声比(CNR)而引起的检测错误可能导致在将荧光信号归因于正确的分子(或分子的克隆扩增簇)时出错。

技术实现思路

[0003]本文公开了被配置成对流动池的第一内表面和第二内表面成像的成像系统，所述成像系统包括：a)物镜；b)至少一个图像传感器；和c)在所述物镜和所述至少一个图像传感器之间的光路上布置的至少一个镜筒透镜；其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(NA)和大于1.0mm2的视场(FOV)；并且其中所述至少一个镜筒透镜被配置为校正成像性能，使得所述流动池的第一内表面和所述流动池的第二内表面的图像具有基本相同的光学分辨率。
[0004]在一些实施方案中，流动池的壁厚为至少700μm，并且在第一内表面和第二内表面之间的流体填充间隙为至少50μm。在一些实施方案中，在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下获取第一内表面和第二内表面的图像。在一些实施方案中，成像系统具有小于0.6的数值孔径(NA)。在一些实施方案中，成像系统具有大于0.3的数值孔径(NA)。在一些实施方案中，成像系统具有大于1.5mm2的视场(FOV)。在一些实施方案中，第一内表面和第二内表面的图像的光学分辨率在整个视场(FOV)上受到衍射限制。在一些实施方案中，至少一个镜筒透镜依次包括不对称凸
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凸透镜、凸
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平透镜、不对称凹
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凹透镜和不对称凸
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凹透镜。在一些实施方案中，成像系统包括两个或更多个镜筒透镜，其被设计为在两个或更多个荧光波长下为第一内表面和第二内表面提供最佳成像性能。在一些实施方案中，成像系统还包括聚焦机构，其被配置为在获取第一内表面和第
二内表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，成像系统被配置为对第一内表面或第二内表面中的至少一个上的两个或更多个视场成像。在一些实施方案中，流动池的第一内表面和第二内表面涂覆有亲水涂层，并且其中所述亲水涂层还包含以>10,000个核酸群落/mm2的表面密度布置在其上的经标记的核酸群落。在一些实施方案中，当核酸群落用花青染料3(Cy3)标记时，使用成像系统获取的第一内表面或第二内表面的图像显示出至少5的对比度噪声比(CNR)，成像系统包括优化用于Cy3发射的二向色镜和带通滤光镜组，并且在将表面浸入25mM ACES pH 7.4缓冲液中的同时，在非信号饱和条件下获取图像。在一些实施方案中，所述成像系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在所述两个不同的表面中的至少一个上的已经用1、2、3或4种不同的可检测标记物标记的核酸群落。在一些实施方案中，成像系统用于监测在第一内表面和第二内表面中的至少一个上的通过亲和力测序、通过核苷酸碱基配对测序、通过核苷酸结合测序或通过核苷酸掺入反应测序，并检测结合或掺入的核苷酸碱基。在一些实施方案中，成像系统用于执行核酸测序。在一些实施方案中，成像系统用于确定样品的基因型，其中确定样品的基因型包括制备从样品中提取的用于测序的核酸分子，然后对核酸分子进行测序。在一些实施方案中，至少一个图像传感器包括像素，所述像素的像素尺寸被选择为使得成像系统的空间采样频率是成像系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，物镜和至少一个镜筒透镜的组合被配置为在样品平面中在700个周期/mm至1100个周期/mm的空间频率范围内优化调制传递函数。在一些实施方案中，对于物镜和至少一个镜筒透镜的组合而言，至少一个镜筒透镜被设计为在一个或多个指定的空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、像散、场曲率、图像畸变、图像对比度噪声比(CNR)或其任何组合方面校正调制传递函数(MTF)。
[0005]本文还公开了核酸分子测序的方法，所述方法包括：a)使用光学系统对第一表面和轴向移位的第二表面进行成像，所述光学系统包括物镜和至少一个图像传感器，其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(NA)和大于1.0mm2的视场(FOV)，并且其中在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下获取具有基本相同的光学分辨率的所述第一表面和所述轴向移位的第二表面的图像；b)检测设置在所述第一表面或所述轴向移位的第二表面上的包含核酸分子或其互补序列的经荧光标记的组合物，以确定核酸分子中核苷酸的身份。
[0006]在一些实施方案中，利用聚焦机构在获取第一表面和轴向移位的第二表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，所述方法还包括在第一表面或轴向移位的第二表面中的至少一个上对两个或更多个视场成像。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面包括流动池的两个表面。在一些实施方案中，流动池的所述两个表面涂覆有亲水涂层。在一些实施方案中，所述亲水涂层还包含以>10,000个核酸群落/mm2的表面密度布置在其上的经标记的核酸群落。在一些实施方案中，当核酸群落用花青染料3(Cy3)标记时，使用所述光学系统获取的所述两个表面的表面图像显示出至少5的对比度噪声比(CNR)，光学系统包括优化用于Cy3发射的二向色镜和带通滤光镜组，并且在将表面浸入25mM ACES pH 7.4缓冲液中的同时，在非信号饱和条件下获取图像。在一些实施方案中，所述光学系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在第一表面和轴向移位的第二表面中的至少一个上的已经用1、2、3或4种不同的可检测标记物标记的核酸群落。在一些实施方案中，至少一个图像传感器包括像素，所述像素的像素尺寸被选择为使得光学系统的
空间采样频率是光学系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，光学系统包括定位在物镜和至少一个图像传感器之间的至少一个镜筒透镜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对核酸分子进行测序的方法，包括：a)提供流动池，所述流动池包括(i)拴在第一表面上的第一多个引物化的靶核酸序列、(ii)拴在第二表面上的第二多个引物化的靶核酸序列，其中所述第二表面从所述第一表面轴向移位；b)在足以偶联(1)所述第一多个引物化的靶核酸序列和所述第二多个引物化的靶核酸序列的至少一个子集和(2)所述多个核苷酸部分的至少一个子集的条件下，当包含多个可检测标记的多个核苷酸部分的核苷酸部分与所述引物化的靶核酸序列的核苷酸互补时，使所述第一多个引物化的靶核酸序列和所述第二多个引物化的靶核酸序列与(i)所述多个核苷酸部分和(ii)聚合酶接触；和c)对所述第一表面和所述第二表面进行成像以检测来自所述多个核苷酸部分的所述子集中的所述多个可检测标记的子集的多个信号，其中所述检测包括：i)在第一组照明条件下用结构化的照明系统提供的第一光照射所述第一表面和所述第二表面，以在所述第一表面和所述第二表面上投射以特定方向定向的第一多个条纹；ii)捕获所述第一表面和所述第二表面的第一多个相位图像，其中在捕获所述第一多个相位图像期间，所述第一多个条纹的位置在所述表面上移动；iii)在第二组照明条件下用所述结构化的照明系统提供的第二光照射所述第一表面和所述第二表面，以在所述第一表面和所述第二表面上投射第二多个条纹，其中所述第二多个条纹从所述表面上的所述第一多个条纹角度偏移；和iv)捕获被所述第二多个条纹照明的所述第一表面和所述第二表面的第二多个相位图像，其中在所述第二多个条纹的捕获期间所述第二多个条纹的位置在所述表面上移动。2.如权利要求1所述的方法，其中所述多个核苷酸部分中的核苷酸部分缀合至聚合物核心以形成缀合的聚合物
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核苷酸。3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一多个条纹和所述第二多个条纹由衍射光栅产生。4.如权利要求3所述的方法，其中所述衍射光栅包括水平光栅、垂直光栅或其任意组合。5.如权利要求3所述的方法，其中所述第一表面由所述垂直光栅照明且所述第二表面由所述水平光栅照明。6.如权利要求3所述的方法，其中所述衍射光栅包括透射相位衍射光栅。7.如权利要求1所述的方法，其中所述结构化的照明系统包括光源。8.如权利要求1所述的方法，其中所述第二多个条纹从所述第一多个条纹偏移约90度。9.如权利要求1所述的方法，其中所述结构化的照明系统包括光学相位调制器或移相器。10.如权利要求9所述的方法，其中所述光学相位调制器或所述移相器将所述第一多个条纹和所述第二多个条纹偏移所述第一多个条纹和所述第二多个条纹的间距的1/2、1/3或1/4。11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述光学相位调制器包括由旋转致动器驱动的旋转光学相位板。12.如权利要求1所述的方法，其中所述结构化的照明系统包括以下一项或多项：
(i)准直光学元件；(ii)偏振器；和(iii)衍射光栅。13.如权利要求1所述的方法，其中所述结构化的照明系统包括组合所述第一光和所述第二光的部分镀银的镜。14.如权利要求1所述的方法，其中所述第一多个相位图像或所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：史蒂夫，
申请(专利权)人：元素生物科学公司，
类型：发明
国别省市：