一种分离乳酸菌的选择培养基及其在肠道乳酸菌分离中的应用制造技术

本发明专利技术属微生物技术领域，为解决乳酸菌选择性培养基研究少，缺乏针对分离基质中的微生物多样性不复杂等问题，提供一种分离乳酸菌的选择培养基及其在肠道乳酸菌分离中的应用。由基础MRS培养基中加入羊骨胶原短肽、抗生素与食品防腐剂；其中：羊骨胶原短肽的添加量为20 mg/L，所述抗生素为多粘菌素E硫酸盐，添加量为47 mg/L；所述食品防腐剂为山梨酸，添加量为1000 mg/L。菌落计数和鉴定结果与粪便微生物高通量测序结果一致。高通量测序结果中优势乳酸菌罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌的相对丰度分别为0.226833%和0.0538%，二者之比为4.6，可从微生态区系复杂的基质中准确高效地分离乳酸菌。菌。菌。

【技术实现步骤摘要】
一种分离乳酸菌的选择培养基及其在肠道乳酸菌分离中的应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种分离乳酸菌的选择培养基及其在肠道乳酸菌分离中的应用。

技术介绍

[0002]抗生素滥用会引发二重感染、耐药菌株及药物残留等一系列问题，给动物和人类健康以及环境造成严重威胁。我国已经禁止在饲料中添加抗生素，对养殖业提出了新的挑战，因而安全、有效、无副作用的抗生素替代品成为必然选择。
[0003]乳酸菌是可用于饲料添加的微生物，可抑制肠道病原菌的生长，维持肠道微生态平衡，增强动物的免疫力，提高生产性能，提高饲料转化率等，并且安全无污染、对动物和人体无毒副作用，因而成为抗生素替代的首要选择。
[0004]乳酸菌广泛存在于人和动物肠道、植物和果蔬表面、发酵食品（泡菜、酸菜）、大曲、酒醅和醋醅等发酵基质中。
[0005]肠道内乳酸菌可维持肠道微生态平衡，抑制病原菌定植，合成和分泌维生素B12，增强机体免疫功能。肠道定植是乳酸菌发挥益生作用的前提。在生产实践中，乳酸菌的益生效果差异很大，菌株定植的宿主特异性被认为是主要原因之一。由于寄主和肠道菌之间存在着特异性相互选择关系，理想的益生菌最好来自同源动物的肠道，所以不同养殖动物肠道乳酸菌的分离和改良育种显得非常重要。同样，在发酵工业中，外源乳酸菌尽管性能优良，但难以适应新的发酵基质和发酵环境，所以发酵环境中土著乳酸菌的分离和育种也十分必要。
[0006]然而，乳酸菌所处的肠道、自然发酵食品、大曲、酒醅、醋醅等发酵菌剂和发酵基质中的微生物类型很多，数量庞大，给乳酸菌分离工作带来严重挑战，因此需要设计一种乳酸菌专用选择培养基，在这种培养基上，酵母菌、霉菌等真菌不生长，革兰氏阴性菌不生长、非目标菌之外的革兰氏阳性菌也不生长，只有目标菌乳酸菌可以生长繁殖，形成菌落。
[0007]目前关于乳酸菌培养基的研究多集中于富集培养基和计数培养基，前者主要用于某一特定纯种乳酸菌的扩大培养，如保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；后者主要用于活性乳酸菌制品中的乳酸菌数量的真实计数。
[0008]选择性培养基主要是通过抑制或杀灭杂菌来分离目标菌，有关乳酸菌选择性培养基设计研究较少。现有研究针对的非目标微生物比较单一或者十分明确，分离基质中的微生物多样性不是很复杂；常用的抑制剂为抗生素，通过单用或复配来实现。

技术实现思路

[0009]本专利技术为了解决目前乳酸菌选择性培养基研究少，缺乏针对分离基质中的微生物多样性不复杂等问题，提供了一种分离乳酸菌的选择培养基及其在肠道乳酸菌分离中的应用。
[0010]本专利技术由如下技术方案实现的：一种分离乳酸菌的选择培养基，由基础MRS培养基中加入羊骨胶原短肽、抗生素与食品防腐剂；其中：羊骨胶原短肽的添加量为20 mg/L，所述抗生素为多粘菌素E硫酸盐，添加量为47 mg/L；所述食品防腐剂为山梨酸，添加量为1000 mg/L。
[0011]所述的分离乳酸菌的选择培养基在肠道乳酸菌分离中的应用。
[0012]前期研究结果表明，羊骨胶原短肽可促进乳酸菌的生长繁殖，并且对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌表现出一定的抑菌效果。为了减少抗生素对乳酸菌形成耐药性胁迫，进一步提高乳酸菌形成率，将抗生素剂量降低到适当水平，在MRS培养基中补充羊骨胶原短肽。
[0013]本专利技术所提供的培养基可用于微生物区系复杂基质中乳酸菌的分离，羊骨胶原短肽
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抗生素
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食品防腐剂联用，对MRS培养基进行改良。羊骨胶原短肽的添加量为2%（20 mg/L)，其作用为促进乳酸菌生长，抑制杂菌，降低抗生素添加量，减少抗生素对微生物造成的选择压力；所用抗生素为多粘菌素E硫酸盐，添加量为47 mg/L，其作用为抑制大肠杆菌和沙门氏菌等革兰氏阴性菌。防腐剂为山梨酸，添加量为1000 mg/L，其作用为抑制芽孢杆菌、酵母菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌。
[0014]当用此培养基分离猪粪便中的乳酸菌时，菌落计数和鉴定结果与粪便微生物高通量测序结果一致。在种水平，不仅分离到优势乳酸菌罗伊氏乳杆菌（61株）和格氏乳杆菌（14株），二者之比为4.36，还分离到丰度极低在高通量测序结果中没有显示的淀粉乳杆菌（6株）和乳酸肠球菌（1株）。高通量测序结果中优势乳酸菌罗伊氏乳杆菌和格氏乳杆菌的相对丰度分别为0.226833%和0.0538%，二者之比为4.6，可见该选择性培养基可从微生态区系复杂的基质中准确高效地分离乳酸菌。
附图说明
[0015]图1为各受试菌在MRS培养基中的生长情况；图中：Bacillus licheniformis为地衣芽孢杆菌；Bacillus natto为纳豆芽孢杆菌；S.aureus为金黄色葡萄球菌；Lactobacillus acidophilus为嗜酸乳杆菌；Lactobacillus reuteri为罗伊氏乳杆菌；Saccharomyces cerevisiae为酿酒酵母；E. coli为大肠杆菌； Salmonella为沙门氏菌；beer yeast为啤酒酵母；图2为各受试微生物在10
‑5稀释度时在MRS琼脂平板上的菌落形成情况；图中：A 乳酸菌混菌液； B 酵母菌混菌液；C 芽孢杆菌混菌液；D 革兰氏阴性菌混菌液；E 金黄色葡萄球菌；图3为各种杂菌和乳酸菌在山梨酸MRS平板上的菌落形成情况；图中：A为山梨酸0mg/L；B为山梨酸1000mg/L；C为山梨酸 2000 mg/L；1为乳酸菌混菌液；2为芽孢杆菌混菌液；3为金黄色葡萄球菌；4为酵母菌混菌液；图4为受试革兰氏阴性菌在含多粘菌素E硫酸盐MRS平板上的生长情况；图中：A，B，C，D为多粘菌素E硫酸盐分别为0 mg/L、32 mg/L、64 mg/L和128 mg/L；1，2，3分别代表乳酸菌混菌液（罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌）、大肠杆菌和沙门氏菌；图5为各种杂菌和乳酸菌在复配选择性培养基上的菌落形成情况；图中：A为杂菌混菌液（改良MRS）；B为乳酸菌混菌液（普通）；C为所有受试菌株混菌液（改良MRS）；D为所有
受试菌混菌液（普通MRS）；图6为猪粪便样品中部分革兰氏阳性菌在乳酸菌选择平板上形成的菌落；图7为部分革兰氏阳性菌菌体形态；图中：R30，R3，R10，R21，R23为罗伊氏乳杆菌；R11格氏乳杆菌；R55为乳酸肠球菌；R33为淀粉乳杆菌；图8为分离的部分革兰氏阳性菌16s rDNA PCR产物电泳结果；图中1：DNA marker;2
‑
23:依次为R3、R5、R10、R11、R21、R23、R33、R55等革兰氏阳性菌16srDNA的PCR产物；图9为48株猪源性罗伊氏乳杆菌16S rDNA系统发育树；图10为在界、门、纲、目、科、属水平上的猪肠道微生物物种分布堆叠图；图中：A1、A2和A3分别代表不同的猪只；乳酸菌的分类地位Domain(bacteria),Phylum(firmicutes),Class(Bacilli),Order(Lactobacillales),Famil本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离乳酸菌的选择培养基，其特征在于：由基础MRS培养基中加入羊骨胶原短肽、抗生素与食品防腐剂；其中：羊骨胶原短肽的添加量为20 mg/L，所述抗生素为多粘菌素...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍乃蕊，杨茹洁，陈丽琴，张鑫鑫，裴雯悦，李宏全，张婷，李涌，刘永强，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：