用于将D-果糖生物转化为D-阿洛酮糖的D-阿洛酮糖3-差向异构酶制造技术

本文提供了用于从广泛多种微生物中鉴定和分离编码具有D

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于将D
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果糖生物转化为D
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阿洛酮糖的D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶
[0001]相关申请
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求2020年5月11日提交的标题为“D
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ALLULOSE 3
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EPIMERASES FOR BIOCONVERSION OF D
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FRUCTOSE TO D
‑
ALLULOSE”的美国临时申请号63/022,617的权益，其内容特此通过引用整体并入。
专利

[0003]本专利技术涉及一种使用D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶由果糖生产D
‑
阿洛酮糖的方法。本专利技术提供了具有D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶活性的多肽，以及编码所述多肽的核酸分子。本专利技术还涉及包含载体的重组核酸构建体和包含重组核酸构建体的重组宿主细胞。

技术介绍

[0004]D
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阿洛酮糖(D
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allulose)，也称为D
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阿洛酮糖(D
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psicose)，是一类结构类似于果糖的糖，果糖是水果中天然存在的糖。D
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阿洛酮糖可以颗粒形式获得并且看起来像蔗糖晶体。阿洛酮糖是一种低热量甜味剂，具有蔗糖甜度的70％。根据美国食品和药品管理局(FDA)，阿洛酮糖提供约0.4卡路里/克，显著低于蔗糖所提供的4卡路里/克。虽然人体有吸收阿洛酮糖的能力，但却缺乏代谢阿洛酮糖的能力。因此，阿洛酮糖对血糖或胰岛素水平几乎没有影响。由于这个原因，阿洛酮糖被认为是一种低热量甜味剂。
[0005]阿洛酮糖以极少的量天然存在于一些食物，诸如干果、红糖和枫糖浆中。阿洛酮糖难以化学合成，并且在本领域中存在对使用重组微生物由容易获得的糖诸如果糖生产阿洛酮糖的需要。

技术实现思路

[0006]来自酮糖3
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差向异构酶家族的酶，包括D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶(D
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allulose 3
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epimerase，DAE；也称为D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶(D
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psicose 3
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epimerase，DPE))，可以催化D
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果糖可逆地转化为D
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阿洛酮糖。D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶对于D
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果糖向D
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阿洛酮糖的生物转化可以具有高活性。本专利技术尤其提供了一种用于使用具有D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶活性的重组多肽由D
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果糖生产D
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阿洛酮糖的方法。
[0007]在一个实施方案中，本专利技术方法涉及使果糖底物与包含酶系统的反应混合物在使得D
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果糖底物转化为D
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阿洛酮糖的条件下接触，所述酶系统包含具有D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶活性的重组多肽。在本专利技术的一个方面，酶系统提供了具有D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶活性的重组多肽和作为底物的D
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果糖以生产作为产物的D
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阿洛酮糖。在本专利技术的另一方面，本专利技术方法可以包括使果糖底物与反应混合物接触，所述反应混合物包含能够表达外源性D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶的宿主细胞或所述宿主细胞的裂解物作为D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶的来源。在该实施方案的某些方面，酶系统中存在的D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶是纯化的酶，并且它可以使用本领域已知的一种或多种生化技术衍生自表达D
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阿洛酮
糖3
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差向异构酶酶的宿主细胞的裂解物。在本专利技术的另一方面，D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶的纯化形式固定化在固体支持物上。在各种实施方案中，本专利技术方法还可以包括向反应系统中添加至少一种类型的金属离子。例如，金属离子可以选自由以下组成的组：镁离子、锰离子、铜离子、锌离子、镍离子、钴离子、铁离子、铝离子和钙离子。在一些优选实施方案中，向反应系统中添加锰离子和/或镁离子。金属离子可以以约0.01mM至约5mM(例如，0.01mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM)的浓度添加。在各个方面，本专利技术方法可以包括移除反应系统中包含不含剩余果糖的阿洛酮糖的产物流。
[0008]在另一个实施方案中，本专利技术提供了编码具有D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶活性的多肽的多核苷酸序列。在该实施方案的一个方面，将编码具有D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶活性的多肽的多核苷酸克隆到具有所需调控元件诸如启动子和终止子的适当的质粒表达载体中。在一个方面，质粒表达载体具有诱导型启动子，从而可以通过使用某些化学品来诱导D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶活性的表达。
[0009]在另一个实施方案中，使用包含编码具有D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶活性的多肽的多核苷酸序列的表达质粒载体转化宿主细胞，包括原核微生物细胞或真核微生物细胞或真核动物细胞或真核植物细胞。在一个方面，转化的宿主细胞内的表达质粒载体作为自我复制的核酸实体存在。在该实施方案的另一方面，表达质粒载体被整合到宿主染色体DNA中。
[0010]在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种用于在涉及D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶的反应中回收不含作为底物的D
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果糖的D
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阿洛酮糖的方法。
[0011]在一些实施方案中，本文所述的生产阿洛酮糖的方法包括使果糖底物与反应混合物在使得果糖底物转化为阿洛酮糖的条件下接触，所述反应混合物包含：
[0012](a)包含D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶的酶系统；
[0013](b)用包含编码D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶的核酸分子的重组载体转化的宿主细胞；和/或
[0014](c)(b)的宿主细胞的裂解物，其中D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶包含与选自由SEQ ID NO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产阿洛酮糖的方法，所述方法包括使果糖底物与反应混合物在使得所述果糖底物转化为阿洛酮糖的条件下接触，所述反应混合物包含：(a)包含D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶的酶系统；(b)用包含编码D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶的核酸分子的重组载体转化的宿主细胞；和/或(c)(b)的所述宿主细胞的裂解物，其中所述D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:43组成的组的多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶，所述酶包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25组成的组的多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25组成的组的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶包含与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25组成的组的多肽具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求2所述的方法，其中所述D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25的氨基酸序列。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶酶，所述酶包含与选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛国红，M，
申请(专利权)人：康纳根有限公司，
类型：发明
国别省市：