使用了基因组编辑多能干细胞的治疗药制造技术

为了治疗脑功能障碍、脑疾病、或肿瘤，提供细胞制剂，其特征在于，包含由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞。因的多能干细胞分化而成的神经干细胞。因的多能干细胞分化而成的神经干细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用了基因组编辑多能干细胞的治疗药


[0001]本专利技术涉及中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂和肿瘤治疗用细胞制剂。该细胞制剂在中枢神经系统疾病损伤，例如脑功能障碍、外伤性脑损伤、脊髓损伤、神经变性疾病、以及脑肿瘤和其他肿瘤的治疗中使用。在使用细胞制剂作为治疗用细胞制剂时，特别是在用于中枢神经系统疾病损伤的治疗的情况下，细胞的肿瘤化成为问题，因为本专利技术的细胞制剂能够通过自杀基因而使细胞灭亡，所以是安全性高的细胞制剂。

技术介绍

[0002]作为外伤性脑损伤的脑挫裂伤主要通过跌倒/交通外伤产生，依然在从年轻人到老年人中大范围、高频率地发病。物理损伤使神经细胞、各种胶质细胞等脑实质的细胞坏死，破坏/损伤神经回路网，带来严重的神经症状，最坏的情况会导致不幸的结局。对脑挫裂伤的治疗针对从受伤开始48小时、特别是最初24小时发生的挫伤性水肿(early massive edema)进行，但是对高渗透压利尿剂等保守性治疗为抵抗性。在通过保守性治疗也意识损伤进展的情况下，通过开颅术摘除挫伤坏死组织，虽然进行手术也能够期待生命预后的改善，但功能预后依然不良(Vella MA.Surg Clin North Am.2017)。
[0003]脑血管意外(脑梗死、脑出血、蛛网膜下出血)是应该称为日本的国民病的疾病，曾经是日本本土死亡原因的第1位。脑梗死通过血流损伤而使神经细胞、各种胶质细胞等脑实质的细胞坏死。破坏/损伤神经回路网，带来严重的神经症状，最坏的情况会导致不幸的结局(Lindvall O.Stroke.2011)。通过对脑梗死超急性期的组织型纤溶酶原激活物(tPA)施与等新的治疗/危险因子的管理等预防医学的进步/公共卫生的改善，脑血管意外的死亡人数现在减少到第3位，但依然是死亡率高的疾病。
[0004]另一方面，神经变性疾病是神经细胞由于各种原因而变性、脱落从而产生的高级脑功能障碍疾病，对于预防、治疗方法进行了大量的研究，但没有使变性、脱落的脑神经系统恢复的治疗药。
[0005]无论如何，现在针对神经功能损伤的治疗法是预防和防止恶化，虽然在与功能损伤对应的康复等中多少能得到一些功能恢复，但在现有的治疗法中，修复作为中枢神经的特征的神经回路网的损伤、获得完全的功能恢复是困难的。由此，以功能恢复、特别是高级脑功能的恢复为目标要求能够实现完全的神经回路网修复的治疗方法。作为再构建损伤了的神经回路网的承担者，考虑干细胞非常有用。作为其方法，有(1)存在于侧脑室下区、海马颗粒下层的内源性神经干细胞的激活和(2)干细胞移植。但是，(1)的新生神经的生存率极低，仅依靠此手段，神经回路网再构建是不可能的。因此，(2)作为损伤神经回路网的再构建的手段是必须的。
[0006]在干细胞移植中，使用怎样的移植供体细胞是重要的。作为移植供体细胞的候选到目前为止提出了各种细胞。到目前为止报告了使用ES细胞来源的神经干细胞(NSC)、间充质干细胞(MSC)的脑挫裂伤动物模型中的功能改善效果(非专利文献1～6)，2014年对慢性期脑挫裂伤患者移植了骨髓来源的MSC(SB623)(非专利文献7)。现在包括正在进行的临床
研究在内，使用MSC的是大多数(NCT02210624)。但是，由MSC带来的作用严格意义上不是以回路网再构建为目标，而是基于移植细胞分泌具有神经营养/保护作用、血管新生促进作用的体液因子，间接地促进再生这样的理论的。
[0007]另一方面，承认了从神经分化能力的高度角度，神经上皮型干细胞作为移植供体细胞优异的报告(非专利文献8)。在以神经干细胞作为供体细胞方面，存在伦理方面/实用方面的问题，但人iPS细胞来源的神经干细胞是能解决这些问题的理想的供体细胞。iPS细胞中也与其他移植细胞疗法同样地存在对致肿瘤性的问题的担心，也研究了不使用作为致肿瘤性的原因之一的c
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Myc等的制作法，但不能完全否定，相反还报告了过于要避免肿瘤化，造成干细胞自身的增殖能力降低、多分化能力丧失(Nakagawa M.Nat Biotechnol 2008；Stadtfeld M.Science.2008)。
[0008]作为肿瘤的治疗药，开发了针对靶标分子的利用各种机制的化学化合物，但由于是化学物质而通常存在副作用的问题，安全的肿瘤治疗剂依然是紧迫的课题。
[0009]现有技术文献
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1:Riess P.J Neurotrauma.2007
[0012]非专利文献2:Tajiri N.Front Syst.Neurosci.2014
[0013]非专利文献3:Tian C.Exp Clin Transplant.2013
[0014]非专利文献4:Qi L.J Craniofac Surg.2018
[0015]非专利文献5:Zanier ER.Crit Care Med.2011
[0016]非专利文献6:Turtzo LC.PLoS One.2015
[0017]非专利文献7:Steinberg GK.Stroke.2016
[0018]非专利文献8:Uchida K.Neurosci Res.2005

技术实现思路

[0019]专利技术要解决的课题
[0020]在考虑临床应用的情况下，能够解决伦理/实用上的问题的人iPS细胞来源的神经干细胞作为供体细胞是理想的。但是，如上所述，iPS细胞也与其他移植细胞疗法同样地有致肿瘤性的问题。本专利技术的第一目的是提供解决了这样的致肿瘤性的问题的人iPS细胞来源的神经干细胞。
[0021]另外，本专利技术者通过将自杀基因(编码能将前药转换成具有细胞毒性的物质的酶的基因)导入人iPS细胞中，然后，诱导成神经干细胞，从而成功地制作了脑肿瘤治疗用细胞制剂(WO2018/207808和WO2019/098361)。本专利技术的第二目的是提供恒常地稳定表达被导入这样的人iPS细胞的自杀基因的手段。
[0022]进而，如果能够事先预测上述的细胞制剂的治疗效果，则能够防止无用的治疗，进行有效的治疗。本专利技术的第三目的是提供预测上述的细胞制剂的治疗效果的手段。
[0023]进而，神经干细胞对肿瘤显示迁移性和指向性，其通过怎样的分子产生尚不明。如果能够将其搞清楚，则能够制作强化了对肿瘤的迁移性和指向性的神经干细胞、有效地挑选迁移性和指向性高的神经干细胞。本专利技术的第四目的是鉴定出带给神经干细胞这样的迁移性、指向性的分子，提供强化了迁移性和指向性的神经干细胞的制作手段、和迁移性和指
向性高的神经干细胞的有效挑选手段。
[0024]进而，在细胞制剂中使用的神经干细胞必须安全性高。但是，在导入自杀基因时使用的CRISPR/Cas9等的基因组编辑技术有在不希望的部位导入突变的脱靶效应的问题。另外，在制作具有自杀基因的神经干细胞时，为了细胞的选择而与自杀基因一起插入耐药性基因等选择标志物基因，但从安全性的观点考虑，期望除去这样的外来基因。本专利技术的第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，包含由被导入了自杀基因的多能干细胞分化而成的神经干细胞。2.根据权利要求1所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在脑功能障碍的治疗中使用。3.根据权利要求1所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在外伤性脑损伤的治疗中使用。4.根据权利要求1所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在脊髓损伤的治疗中使用。5.根据权利要求1所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在神经变性疾病的治疗中使用。6.根据权利要求1所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在脑肿瘤的治疗中使用。7.根据权利要求1～6中任一项所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，自杀基因被插入到了多能干细胞的紧接着β
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肌动蛋白基因的翻译区域之后的3
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侧。8.根据权利要求7所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，在多能干细胞的紧接着β
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肌动蛋白基因的翻译区域之后的3
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侧连接有编码2A肽的序列，在编码该2A肽的序列的3
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侧连接有自杀基因。9.根据权利要求1～8中任一项所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是在其基因组中不包含选择标志物基因的神经干细胞。10.根据权利要求9所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是通过包括以下的工序(A)～(D)的方法得到的神经干细胞，工序(A)，是通过基因组编辑而在多能干细胞的基因组中插入基因构建物的工序，所述基因构建物是包含自杀基因、选择标志物基因、和Cre蛋白质的二个靶标序列，并且选择标志物基因夹在Cre蛋白质的二个靶标序列之间的基因构建物，工序(B)，通过选择标志物基因，从工序(A)中得到的多能干细胞中选择基因组中被插入了自杀基因的多能干细胞，工序(C)，通过Cre蛋白质，从工序(B)中得到的多能干细胞的基因组中除去选择标志物基因，工序(D)，使工序(C)中得到的多能干细胞分化成神经干细胞。11.根据权利要求10所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，Cre蛋白质的靶标序列是loxP序列。12.根据权利要求10所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，基因构建物所包含的Cre蛋白质的二个靶标序列是在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列，在基因构建物中，在上游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的上游，在下游重复序列中具有突变的突变loxP序列位于选择标志物基因的下游。13.根据权利要求9所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是通过包括以下的工序(a)～(d)的方法得到的神经干细胞，
工序(a)，是通过基因组编辑在多能干细胞的基因组中插入基因构建物的工序，所述基因构建物是包含自杀基因、选择标志物基因、在重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在间隔序列中具有突变的突变loxP序列，并且选择标志物基因夹在所述二个突变loxP序列之间的基因构建物，工序(b)，通过选择标志物基因，从工序(a)中得到的多能干细胞中，选择基因组中被插入了自杀基因的多能干细胞，工序(c)，是在通过Cre蛋白质和同源重组载体从工序(b)中得到的多能干细胞的基因组除去选择标志物基因的同时，在基因组中插入第2基因的工序，所述同源重组载体是包含第2基因、在重复序列中具有突变的突变loxP序列、和在间隔序列中具有突变的突变loxP序列，并且第2基因夹在所述二个突变loxP序列之间的同源重组载体，工序(d)，使工序(c)中得到的多能干细胞分化成神经干细胞。14.根据权利要求10～13中任一项所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，基因组编辑是利用CRISPR/Cas3的基因组编辑。15.根据权利要求1～14中任一项所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，自杀基因是胞嘧啶脱氨酶基因和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因。16.根据权利要求15所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，与能被胞嘧啶脱氨酶转换成5
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氟尿嘧啶的前药一起使用。17.根据权利要求1～16中任一项所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是使选自肝配蛋白A受体、肝配蛋白A、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4中的至少一者的表达量增加了的神经干细胞。18.根据权利要求17所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是使肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4的表达量增加了的神经干细胞。19.根据权利要求1～16中任一项所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是以选自肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4中的至少一者的表达量作为指标挑选出的神经干细胞。20.根据权利要求19所述的中枢神经系统疾病/损伤治疗用细胞制剂，其特征在于，神经干细胞是以肝配蛋白A、肝配蛋白A受体、肝配蛋白B受体、肝配蛋白B和CXC基序型趋化因子受体4作为指标挑选出的神经干细胞。21.神经干细胞的制造方法，其特征在于，包括以下的工序(1)和(2)，工序(1)，通过基因组编辑，在多能干细胞的紧接着β
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肌动蛋白基因的翻译区域之后的3
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侧插入自杀基因，工序(2)，使工序(1)中得到的多能干细胞向神...

【专利技术属性】
技术研发人员：户田正博，冈野荣之，田村亮太，佐藤瑞仁，杨正博，
申请(专利权)人：学校法人庆应义塾，
类型：发明
国别省市：