本公开提供测定含多特异性抗原结合分子的组合物中的轻链交换体分子含有量的分析方法。本公开的分析方法包括：处理含多特异性抗原结合分子的组合物并制备多种F(ab)片段的工序，以及通过基于电荷或疏水性相互作用的分离法测定该F(ab)片段并求出各片段的含有量(含有比率)的工序。有比率)的工序。有比率)的工序。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】含多特异性抗原结合分子的组合物中的杂质分子的分析方法
[0001]本公开涉及含多特异性抗原结合分子的组合物中的杂质分子的分析方法。更具体地，本公开涉及对含多特异性抗原结合分子的组合物中的由于该多特异性抗原结合分子的轻链的错配而生成的轻链交换体分子的含有量进行定量的方法，包括处理组合物中含有的分子并生成多种F(ab)片段的工序和测定该F(ab)片段并测定各片段的含有量或者含有比率的工序。
技术介绍
[0002]非共同轻链的多特异性抗原结合分子(尤其是双特异性抗体)具有2种重链(H1，H2)和2种轻链(L1，L2)，因此，在培养工序中，除了目标分子(H1L1/H2L2)之外，还生成9种由于重链之间或者重链与轻链的错配导致的杂质分子(图5)。为了抑制这些杂质分子，已知有称为Knobs
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into
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holes的技术(专利文献1)、利用了重链之间或者重链
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轻链间的电荷控制的技术(专利文献2、专利文献3)。此外，已知对于生成的杂质分子，在重链、轻链的氨基酸残基中引入改变，利用目标分子与杂质分子的pI差异通过色谱法分离进行去除的技术(专利文献4)。
[0003]但是，利用pI差异的分离方法最多可分离出杂质分子中的8种，但剩下的1种应该与H1和H2配对的L1，L2反转的杂质分子(H1L2/H2L1，以下简称轻链交换分子)由于包括理论pI在内的物理性质与目标分子相同，无法分离。因此，在质量管理上需要准确测量纯化工序结束后得到的组合物中是否含有轻链交换体分子以及含量或含有比率的方法。
[0004]Yin等公开了含有轻链交换体分子的杂质分子的分析方法(非专利文献1)。该文献使用了这样的方法：将各分子分离为F(ab)，进行质谱分析，使用其质谱分析结果和基于重链
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轻链的组合的概率的理论计算算出各分子的含有量的估计值的方法。但是，该方法并不是从分析结果直接测定含有量，还停留在使用理论计算得到估计值，因此，无法准确地定量轻链交换体分子。
[0005]现有技术文献
[0006]专利文献
[0007]专利文献1：WO96/27011
[0008]专利文献2：WO2006/106905
[0009]专利文献3：WO2013/065708
[0010]专利文献4：WO2007/114325
[0011]非专利文献：
[0012]非专利文献1：Yin et.al.，MABS2016，VOL.8，NO.8，1467
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技术实现思路
[0013]专利技术所要解决的问题
[0014]本公开中的专利技术是鉴于上述情况而作出的，目的在于，在一个非限定性的实施方
式中，提供区分组合物中含有的目标多特异性抗原结合分子与轻链交换体分子进行定量的分析方法。
[0015]用于解决问题的方法
[0016]在一个非限定性的实施方式中，本专利技术人等经过深入研究后发现，利用多特异性抗原结合分子和轻链交换体分子中含有的F(ab)片段的组合的不同测定组合物中含有的多特异性抗原结合分子和轻链交换体分子的含有量(含有比率)的分析方法。具体地，通过处理组合物中含有的分子生成多种F(ab)片段，利用其电荷差等分离各F(ab)片段，测定各自的含有量(含有比率)，能够测定组合物中是否含有轻链交换体分子、以及含有量或含有比率。
[0017]本公开基于这些认知，具体包含以下例示性记载的实施方式。
[0018][1]一种含多特异性抗原结合分子的组合物中轻链交换体分子的分析方法，
[0019]多特异性抗原结合分子为含有第一F(ab)(H1L1)和第二F(ab)(H2L2)的分子(H1L1/H2L2)，所述第一F(ab)(H1L1)含有针对第一抗原的第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域，所述第二F(ab)(H2L2)含有针对第二抗原的第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域，
[0020]轻链交换体分子为含有第三F(ab)(H1L2)和第四F(ab)(H2L1)的分子(H1L2/H2L1)，所述第三F(ab)(H1L2)含有第一重链可变结构域和第二轻链可变结构域，所述第四F(ab)(H2L1)含有第二重链可变结构域和第一轻链可变结构域，
[0021]分析方法为包括以下工序1～2的方法：
[0022]工序1：处理含多特异性抗原结合分子的组合物，生成2种以上的F(ab)片段的工序；
[0023]工序2：通过基于电荷或疏水性相互作用的分离法测定2种以上的F(ab)片段，求出组合物中轻链交换体分子的含有量或者轻链交换体分子相对于多特异性抗原结合分子的含有比率的工序。
[0024][2]根据[1]的方法，工序1包括以下工序1
‑
1和工序1
‑
2：
[0025]工序1
‑
1：切割组合物中含有的分子，生成F(ab)
’
2片段的工序；
[0026]工序1
‑
2：切割F(ab)
’
2片段，生成2种以上的F(ab)片段的工序。
[0027][3]根据[2]的方法，工序1
‑
1为通过蛋白酶切割组合物中含有的分子的铰链部的Fc侧的工序。
[0028][4]根据[3]的方法，蛋白酶为来源于细菌的抗体降解酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶(ficin)的任一者或者它们的组合。
[0029][5]根据[2]～[4]的任一项所述的方法，工序1
‑
2为通过还原剂切割F(ab)
’
2片段的二硫键的工序。
[0030][6]根据[5]的方法，还原剂为TCEP、2
‑
MEA、半胱氨酸、二硫苏糖醇、2
‑
巯基乙醇、3
‑
巯基
‑
1，2
‑
丙二醇、TBP的任一者或者它们的组合。
[0031][7]根据[1]的方法，工序1为通过蛋白酶切割组合物中含有的分子的铰链部的F(ab)侧的工序。
[0032][8]根据[7]的方法，蛋白酶为来源于细菌的抗体降解酶、木瓜蛋白酶、Lys
‑
C的任一者或者它们的组合。
[0033][9]根据[1]～[8]的任一项所述的方法，工序2为通过阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、反相色谱的任一者或者它们的组合测定2种以上的F(ab)片段的工序。
[0034][10]根据[1]～[9]的任一项所述的方法，工序1中生成的2种以上的F(ab)片段的等电点各不相同。
[0035][11]根据[1]～[10]的任一项所述的方法，多特异性抗原结合分子(H1L1/H2L2)为改变了氨基酸残基使得与以下杂质(1)～(8)之间的等电点存在差异的分子：
[0036](1)含有第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域的第一F(ab)(本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含多特异性抗原结合分子的组合物中的轻链交换体分子的分析方法，其中，多特异性抗原结合分子为含有第一F(ab)(H1L1)和第二F(ab)(H2L2)的分子(H1L1/H2L2)，所述第一F(ab)(H1L1)含有针对第一抗原的第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域，所述第二F(ab)(H2L2)含有针对第二抗原的第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域，轻链交换体分子为含有第三F(ab)(H1L2)和第四F(ab)(H2L1)的分子(H1L2/H2L1)，所述第三F(ab)(H1L2)含有第一重链可变结构域和第二轻链可变结构域，所述第四F(ab)(H2L1)含有第二重链可变结构域和第一轻链可变结构域，其中，分析方法包括以下工序1～2：工序1：处理含多特异性抗原结合分子的组合物，生成2种以上的F(ab)片段的工序；工序2：通过基于电荷或疏水性相互作用的分离法测定2种以上的F(ab)片段，求出组合物中轻链交换体分子的含有量或者轻链交换体分子相对于多特异性抗原结合分子的含有比率的工序。2.根据权利要求1所述的方法，其中，工序1包括以下工序1
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1和1
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2：工序1
‑
1：切割组合物中含有的分子，生成F(ab)
’
2片段的工序；工序1
‑
2：切割F(ab)
’
2片段，生成2种以上的F(ab)片段的工序。3.根据权利要求2所述的方法，其中，工序1
‑
1为通过蛋白酶切割组合物中含有的分子的铰链部的Fc侧的工序。4.根据权利要求3所述的方法，其中，蛋白酶为来源于细菌的抗体降解酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶的任一者或者它们的组合。5.根据权利要求2～4的任一项所述的方法，其中，工序1
‑
2为通过还原剂切割F(ab)
’
2片段的二硫键的工序。6.根据权利要求5所述的方法，其中，还原剂为TCEP、2
‑
MEA、半胱氨酸、二硫苏糖醇、2
‑
巯基乙醇、3
‑
巯基
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1，2
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丙二醇、TBP的任一者或者它们的组合。7.根据权利要求1所述的方法，其中，工序1为通过蛋白酶切割组合物中含有的分子的铰链部的F(ab)侧的工序。8.根据权利要求7所述的方法，其中，蛋白酶为来源于细菌的抗体降解酶、木瓜蛋白酶、Lts
‑
C的任一者或者它们的组合。9.根据权利要求1～8的任一项所述的方法，其中，工序2为通过阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、反相色谱的任一者或者它们的组合测定2种以上的F(ab)片段的工序。10.根据权利要求1～9的任一项所述的方法，其中，工序1中生成的2种以上的F(ab)片段的等电点各不相同。11.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：佐藤元彦，村田博子，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：
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