用于碱基多样化的组合物、系统和方法技术方案

本申请描述了修饰或编辑靶核酸的方法，例如将胞嘧啶编辑为胸腺嘧啶和将腺嘌呤编辑为鸟嘌呤的方法和/或将胞嘧啶编辑为胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤的方法。本申请还描述了用于修饰或编辑靶核酸的组合物和系统。本申请所述的方法、组合物和系统可用于产生等位基因多样性。性。性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于碱基多样化的组合物、系统和方法
[0001]关于序列表电子提交的声明
[0002]根据37C.F.R.
§
1.821提交的ASCII文本格式的序列表，标题为1499
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9WO_ST25，大小为609,139字节，生成于2021年1月29日，并通过EFS
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Web提交，提供代替纸质副本。该序列表在此通过引用并入本说明书的公开内容。


[0003]本专利技术涉及修饰或编辑靶核酸的方法，例如将胞嘧啶编辑为胸腺嘧啶和将腺嘌呤编辑为鸟嘌呤的方法和/或将胞嘧啶编辑为胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤的方法。本专利技术进一步涉及用于修饰或编辑靶核酸的组合物和系统。

技术介绍

[0004]虽然CRISPR
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Cas9和相关技术提供了一种在基因座内产生靶向突变的方法，但它们产生的产物类型是非常确定的。当前的CRISPR技术不擅长以半随机方式产生等位基因多样性。等位基因多样性的产生对于发现新的表型和性状是有价值的。因此，能够从单一工具产生多种结果的新方法将是有利的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一方面涉及修饰靶核酸的方法，该方法包括：使靶核酸接触：CRISPR
‑
Cas效应蛋白(例如，CRISPR酶)、指导核酸(指导RNA)、胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶，其中CRISPR
‑
Cas效应蛋白、胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶形成复合物或包含在复合物中，从而修饰靶核酸。该方法可以进一步包括使用修饰的靶核酸确定期望的或优选的表型。
[0006]本专利技术的另一方面涉及碱基编辑组合物或系统，其包含：CRISPR
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Cas效应蛋白(例如，CRISPR酶)、指导核酸(例如，指导RNA)、胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶，其中CRISPR
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Cas效应蛋白、胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶形成复合物或包含在复合物中。
[0007]本专利技术的另一方面涉及修饰靶核酸的方法，该方法包括：使靶核酸接触：CRISPR
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Cas效应蛋白(例如，CRISPR酶)、指导核酸(例如，指导RNA)和胞嘧啶脱氨酶，其中该方法将靶核酸的胞嘧啶(C)修饰为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)，从而修饰靶核酸。该方法可以进一步包括使用修饰的靶核酸确定期望的或优选的表型。
[0008]本专利技术的另一方面涉及碱基编辑组合物或系统，其包含：CRISPR
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Cas效应蛋白(例如，CRISPR酶)、指导核酸(例如，指导RNA)和胞嘧啶脱氨酶，其中所述组合物或系统不含糖基化酶抑制剂(例如，尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI))。
[0009]本专利技术进一步提供了包含本专利技术的核酸构建体的表达盒和/或载体，以及包含本专利技术的多肽、融合蛋白和/或核酸构建体的细胞。此外，本专利技术提供了包含本专利技术的核酸构建体和包含其的表达盒、载体和/或细胞的试剂盒。
[0010]应当注意，关于一个实施方案描述的本专利技术的方面可以并入不同的实施方案中，尽管没有相对于其的具体描述。也就是说，所有实施方案和/或任何实施方案的特征可以以
任何方式和/或组合进行组合。申请人保留更改任何最初提交的权利要求和/或相应地提交任何新的权利要求的权利，包括能够修改任何最初提交的权利要求以依赖和/或合并任何其他权利要求的任何特征的权利要求，尽管最初没有以这种方式提出要求。本专利技术的这些和其他目的和/或方面在下面阐述的说明书中详细解释。本领域普通技术人员通过阅读附图和随后的优选实施方案的详细描述将理解本专利技术的其他特征、优点和细节，这样的描述仅是对本专利技术的说明。
附图说明
[0011]图1是显示根据本专利技术一些实施方案使用MS2/MCP系统的C
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和A
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碱基编辑结果的图。
[0012]图2是显示根据本专利技术一些实施方案使用具有Cas9的SunTag系统的C
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和A
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碱基编辑结果的图。
[0013]图3提供了显示根据本专利技术一些实施方案使用TREE系统的C
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和A
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碱基编辑结果的图。
[0014]图4是显示根据本专利技术一些实施方案使用与MCP融合的各种脱氨酶结构域的反式募集而由Cas9(D10A)介导的碱基多样化的图。
[0015]图5是显示根据本专利技术的一些实施方案的碱基多样化可以在不存在UGI的情况下产生显著量的插入缺失突变，而无论脱氨酶结构域如何的图。
[0016]图6提供了显示根据本专利技术一些实施方案对靶碱基进行C编辑以及CRT0044876降低插入缺失突变率的图。
[0017]图7
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26是显示根据本专利技术一些实施方案的关于各个间隔区序列的碱基编辑百分比的图。
[0018]图27是显示根据本专利技术一些实施方案由具有或不具有Gam的胞嘧啶脱氨酶产生的插入缺失(indels)百分比的图。
具体实施方式
[0019]现在将在下文中参考附图和实施例来描述本专利技术，其中示出了本专利技术的实施方案。该描述并非旨在成为可以实施本专利技术的所有不同方式或可以添加到本专利技术的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案说明的特征可以并入其他实施方案中，并且关于特定实施方案说明的特征可以从该实施方案中删除。因此，本专利技术设想在本专利技术的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。此外，根据本公开内容，本文提出的各种实施方案的许多变化和添加对于本领域技术人员来说将是显而易见的，它们不脱离本专利技术。因此，以下描述旨在示例说明本专利技术的一些特定实施方案，而不是详尽地指定其所有排列、组合和变化。
[0020]除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在本文的本专利技术的描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本专利技术。
[0021]本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入，以用于与在其中呈现参考文献的句子和/或段落相关的教导。
[0022]除非上下文另有说明，否则本文所述的本专利技术的各种特征特别旨在以任何组合形式使用。此外，本专利技术还设想在本专利技术的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。为了示例说明，如果说明书声明组合物包含组分A、B和C，则特别意在A、B或C中的任何一个或其组合可以单独或以任何组合被省略和排除。
[0023]如在本专利技术的描述和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。
[0024]同样如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关列出的项目的任何和所有可能的组合，以及当解释为备选方案(“或”)时缺少组合。
[0025]如本文所用的术语“约”在提及诸如量或浓度等的可测量值时，意在包括所述值的
±
10％、
±
5％、
±...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种修饰靶核酸的方法，所述方法包括：使靶核酸接触：CRISPR
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Cas效应蛋白(例如，CRISPR酶)，指导核酸(例如，指导RNA)，胞嘧啶脱氨酶，和腺嘌呤脱氨酶，其中胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶并行地和/或同时地修饰靶核酸，任选地在包含CRISPR
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Cas效应蛋白、胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶的试剂的单次递送中进行修饰，和/或其中CRISPR
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Cas效应蛋白与胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶形成复合物或包含在复合物中，从而修饰靶核酸。2.权利要求1所述的方法，其中指导核酸包含RNA募集基序，任选地其中RNA募集基序是MS2发夹。3.权利要求1或2所述的方法，其中CRISPR
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Cas效应蛋白包含指导核酸或复合物进一步包含指导核酸。4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中将CRISPR
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Cas效应蛋白融合至胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶。5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中将胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶不融合至Cas9。6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中将胞嘧啶脱氨酶与腺嘌呤脱氨酶融合在一起以提供融合蛋白，任选地其中融合蛋白包含SEQ ID NO：79
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83中任一项的序列的全部或部分。7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶包含MS2加帽蛋白(MCP)或其部分，任选地其中将胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶与MCP或其部分融合在一起。8.权利要求7所述的方法，其中MCP蛋白或其部分结合RNA募集基序(例如，MS2发夹)。9.权利要求2
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8中任一项所述的方法，其中使用MS2发夹将胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶募集至靶核酸。10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中使靶核酸接触进一步包括使靶核酸接触CRISPR
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Cas效应蛋白、指导核酸、胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶和糖基化酶抑制剂(例如，尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI))。11.权利要求10所述的方法，其中将糖基化酶抑制剂融合至CRISPR
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Cas效应蛋白、胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶。12.前述权利要求中任一项所述的方法，其中CRISPR
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Cas效应蛋白包含肽标签(例如，SunTag)，任选地其中肽标签包含一个或多个(例如，1、2、3、4或更多个)GCN4表位。13.权利要求12所述的方法，其中腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶包含能够结合肽标签的亲和多肽(例如，scFv)，任选地其中将腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶与亲和多肽融合一起。14.权利要求13所述的方法，其中使用亲和多肽将胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶募集至靶核酸。
15.权利要求12
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14中任一项所述的方法，其中通过融合至MCP或其部分将肽标签(例如，Sun Tag)募集至RNA募集基序(例如，MS2发夹)并且使用亲和多肽将胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶募集至肽标签。16.权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶包含肽标签(例如SunTag)，任选地其中肽标签包含一个或多个(例如1、2、3、4或更多个)GCN4表位。17.权利要求16所述的方法，其中CRISPR
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Cas效应蛋白包含能够结合肽标签的亲和多肽(例如，scFv)，任选地其中将CRISPR
‑
Cas效应蛋白与亲和多肽融合在一起。18.权利要求17所述的方法，其中使用亲和多肽将CRISPR
‑
Cas效应蛋白募集至靶核酸。19.权利要求16
‑
18中任一项所述的方法，其中将肽标签(例如，Sun Tag)募集至RNA募集基序(例如，MS2发夹)并且使用亲和多肽将CRISPR
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Cas效应蛋白募集至肽标签。20.前述权利要求中任一项所述的方法，其中CRISPR
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Cas效应蛋白是V型CRISPR
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Cas效应蛋白。21.前述权利要求中任一项所述的方法，其中靶核酸在基因的非编码区(例如，启动子区)中或其中靶核酸在基因的编码区中。22.前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括使靶核酸接触目标多肽(例如，包含SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：113的全部或部分的多肽)，任选地其中将目标多肽融合至CRISPR
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Cas效应蛋白、胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶。23.一种碱基编辑组合物或系统，包括：CRISPR
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Cas效应蛋白(例如，CRISPR酶)，指导核酸(例如，指导RNA)，胞嘧啶脱氨酶，和腺嘌呤脱氨酶，其中CRISPR
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Cas效应蛋白、胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶形成复合物或包含在复合物中。24.权利要求23所述的碱基编辑组合物或系统，其中指导核酸包含RNA募集基序，任选地其中RNA募集基序是MS2发夹。25.权利要求23或24所述的碱基编辑组合物或系统，其中CRISPR
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Cas效应蛋白包含指导核酸和/或复合物进一步包含指导核酸。26.权利要求23
‑
25中任一项所述的碱基编辑组合物或系统，其中将CRISPR
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Cas效应蛋白融合至胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶。27.权利要求23
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26中任一项所述的碱基编辑组合物或系统，其中将胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶不融合至Cas9。28.权利要求23
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27中任一项所述的碱基编辑组合物或系统，其中将胞嘧啶脱氨酶与腺嘌呤脱氨酶融合在一起以提供融合蛋白，任选地其中融合蛋白包含SEQ ID NO：79
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83中任一项的序列的全部或部分。29.权利要求23
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28中任一项所述的碱基编辑组合物或系统，其中胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶包含MS2加帽蛋白(MCP)或其部分，任选地其中将胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶与MCP或其部分融合在一起。30.权利要求29所述的碱基编辑组合物或系统，其中MCP蛋白或其部分结合至RNA募集
基序(例如，MS2发夹)。31.权利要求23
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30中任一项所述的碱基编辑组合物或系统，还包含糖基化酶抑制剂(例如，尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI))和/或目标多肽(例如，包含SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：113的全部或部分的多肽)，任选地其中将糖基化酶抑制剂和/或目标多肽融合至CRISPR
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Cas效应蛋白、胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶。32.权利要求31所述的碱基编辑组合物或系统，其中将糖基化酶抑制剂融合至CRISPR
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Cas效应蛋白、胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶。33.权利要求23
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32中任一项所述的碱基编辑组合物或系统，其中CRISPR
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Cas效应蛋白包含肽标签(例如，SunTag)，任选地其中肽标签包含一个或多个(例如，1、2、3、4或更多个)GCN4表位。34.权利要求33所述的碱基编辑组合物或系统，其中腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶包含能够结合肽标签的亲和多肽(例如，scFv)，任选地其中将腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶与亲和多肽融合在一起。35.权利要求34所述的碱基编辑组合物或系统，其中使用亲和多肽将胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶募集至靶核酸。36.权利要求33
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35中任一项所述的碱基编辑组合物或系统，其中通过融合至MCP或其部分将肽标签(例如Sun Tag)募集至RNA募集基序(例如MS2发夹)并且使用亲和多肽将胞嘧啶脱氨酶和/或腺嘌呤脱氨酶募集至肽标签。37.权利要求23
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32中任一项所述的碱基编辑组合物或系统，其中腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶包含肽标签(例如SunTag)，任选地其中肽标签包含一个或多个(例如1、2、3、4或更多个)GCN4表位。38.权利要求37所述的碱基编辑组合物或系统，其中CRISPR
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Cas效应蛋白包含能够结合肽标签的亲和多肽(例如，scFv)，任选地其中将CRISPR
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Cas效应蛋白与亲和多肽融合一起。39.权利要求38所述的碱基编辑组合物或系统，其中使用亲和多肽将CRISPR
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Cas效应蛋白募集至靶核酸。40.权利要求37
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39中任一项所述的碱基编辑组合物或系统，其中将肽标签(例如，Sun Tag)募集至RNA募集基序(例如，MS2发夹)并且使用亲和多肽将CRISPR
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Cas效应蛋白募集至肽标签。41.权利要求23
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40中任一项所述的碱基编辑组合物或系统，其中CRISPR
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Cas效应蛋白是V型CRISPR
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Cas效应蛋白。42.一种修饰靶核酸的方法，所述方法包括：使靶核酸接触：CRISPR
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Cas效应蛋白(例如，CRISPR酶)，指导核酸(例如，指导RNA)，和胞嘧啶脱氨酶，其中所述方法将靶核酸的胞嘧啶(C)修饰为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)，从而修饰靶核酸。43.权利要求42所述的方法，其中胞嘧啶脱氨酶是载脂蛋白B mRNA
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编辑复合物
(APOBEC)脱氨酶(例如APOBECl脱氨酶、APOBEC2脱氨酶、APOBEC3A脱氨酶、APOBEC3B脱氨酶、APOBEC3C脱氨酶、APOBEC3D脱氨酶、APOBEC3F脱氨酶、APOBEC3G脱氨酶、APOBEC3H脱氨酶、APOBEC4脱氨酶和/或rAPOBECl脱氨酶)、人活化诱导脱氨酶(hAID)、FERNY脱氨酶和/或CDA1脱氨酶(例如，pmCDA1、atCDA1(例如，At2g19570))和/或其进化形式，任选地其中胞嘧啶脱氨酶包含SEQ ID NO：40
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49中任一项的氨基酸序列的全部或部分。44.权利要求42或43所述的方法，其中使靶核酸接触进一步包括使靶核酸接触CRISPR
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Cas效应蛋白、指导核酸、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶N
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糖基化酶(UNG)。45.权利要求42
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44中任一项所述的方法，其中所述方法包括调节CRISPR
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Cas效应蛋白的DNA结合亲和力。46.权利要求42
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45中任一项所述的方法，其中指导核酸与靶核酸具有不完全的互补性。47.权利要求42
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46中任一项所述的方法，其中CRISPR
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Cas效应蛋白包含Cas9，...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y，
申请(专利权)人：成对植物服务股份有限公司，
类型：发明
国别省市：