本发明专利技术公开了一种基于基因改造脊椎动物的携带通用定点偶联接口的抗体的制备方法。本发明专利技术提供了一种脊椎动物模型的构建方法，所述脊椎动物模型用于生产携带通用定点偶联接口的抗体；所述方法包括如下步骤：在受体动物的基因组中免疫球蛋白的某一编码基因A的某一位置A处定点敲入某种连接酶A的特异性识别序列的编码基因或某种内含肽A的编码基因，得到所述脊椎动物模型。本发明专利技术被改造小鼠可以正常激发免疫反应，生成带定点连接位点的多克隆抗体与单克隆抗体，带定点连接位点的抗体可以正常进行定点连接，加上各种应用基团，实现抗体下游应用，比如ELISA，免疫荧光染色，免疫PCR。免疫PCR。
【技术实现步骤摘要】
一种基于基因改造脊椎动物的携带通用定点偶联接口的抗体的制备方法
[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于基因改造脊椎动物的携带通用定点偶联接口的抗体的制备方法。
技术介绍
[0002]脊椎动物，如鼠，兔，羊，鸡，骆驼等是开发单克隆抗体和多克隆抗体的重要动物平台。
[0003]以往研究表明，在抗体定点位置引入特定氨基酸序列，可以实现通过连接酶，如Sortase，butelase，oaAEP1，介导的特异性连接反应，可以定点的引入若干基团。
[0004]目前为止，现有技术中未见在动物水平直接对抗体编码基因进行基因编辑，定点敲入接口编码基因，进而获得可以直接生产自带接口的抗体的动物的相关报道。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供一种基于基因改造脊椎动物的携带通用定点偶联接口的抗体的制备方法。
[0006]第一方面，本专利技术要求保护一种脊椎动物模型的构建方法，所述脊椎动物模型用于生产携带通用定点偶联接口的抗体。
[0007]本专利技术所要求保护的脊椎动物模型的构建方法，可包括如下步骤：在受体动物的基因组中免疫球蛋白的某一编码基因A的某一位置A处定点敲入某种连接酶A的特异性识别序列的编码基因或者某种内含肽(intein)A的编码基因，得到所述脊椎动物模型。
[0008]在所述方法中，所述编码基因A为Igkc基因(即抗体kappa轻链的恒定区结构域编码基因)，所述位置A为Igkc基因的3
’
端。即在抗体水平，所述连接酶A的特异性识别序列将被定点插入到抗体kappa型轻链的C端。
[0009]在所述方法中，所述脊椎动物可选自如下任一：小鼠、大鼠、兔、羊、鸡、骆驼、马、驴、仓鼠、豚鼠、羊驼。
[0010]在本专利技术的具体实施方式中，所述脊椎动物为小鼠；所述编码基因A为小鼠基因组中6号染色体上的Igkc基因；所述位置A位于小鼠基因组中6号染色体上的Igkc基因(Gene ID:16071)的第70726754和第70726755位(小鼠基因组GRcm38/mm10版本)之间。
[0011]在所述方法中，所述连接酶A可选自如下任一：Sortase
staph
酶、Sortase
strep
酶、Butelase酶、oaAEP1酶、Formylglycine生成酶(FGE)、谷胺酰转氨酶、微管蛋白酪氨酸连接酶(Tubulin Tyrosine Ligase；TTL)、Trypsiligase、Sfp phosphopantetheinyl转移酶、SpyLigase。
[0012]当所述连接酶A为Sortase
staph A(以下统称Sortase A)酶时，所述特异性识别序列可为LPXTG(X为任意氨基酸)；当所述连接酶A为Sortase
strep
酶时，所述特异性识别序列可为LPXTA(X为任意氨基酸)；当所述连接酶A为Butelase酶时，所述特异性识别序列可为NHV；当
所述连接酶A为oaAEP1酶时，所述特异性识别序列可为NGL；当所述连接酶A为Formylglycine生成酶时，所述特异性识别序列可为CXPXR(X为任意氨基酸)；当所述连接酶A为谷胺酰转氨酶时，所述特异性识别序列可为LLQGA；当所述连接酶A为微管蛋白酪氨酸连接酶时，所述特异性识别序列可为VDSVEGEEEGEE；当所述连接酶A为Trypsiligase时，所述特异性识别序列可为YRH；当所述连接酶A为Sfp phosphopantetheinyl转移酶时，所述特异性识别序列可为DSLEFIASKLA；当所述连接酶A为Sfp phosphopantetheinyl转移酶时，所述特异性识别序列可为DSLEFIASKLA；当所述连接酶A为SpyLigase时，所述特异性识别序列可为AHIVMVDAYKPTK或ATHIKFSKRD。
[0013]在所述方法中，所述定点敲入可通过CRISPR/Cas9技术实现。
[0014]进一步地，作为被Cas9核酸酶切割的靶序列位于所述受体动物的基因组中免疫球蛋白的所述编码基因A的所述位置A上下游500bp范围内，以便通过同源重组机制插入特异性识别序列的DNA。
[0015]在本专利技术的具体实施方式中，所述靶序列具体为SEQ ID No.1(即GGAATGAGTGTTAGAGA*CAAAGG，其中*是Cas9切割位置)(此时，所述脊椎动物为小鼠，所述免疫球蛋白的所述编码基因A的所述位置A位于小鼠基因组中6号染色体上的Igkc基因(Gene ID:16071)的第70726754位和第和第70726755位(小鼠基因组GRcm38/mm10版本)。
[0016]进一步地，作为定点敲入工具的同源重组载体上含有DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次由5
’
同源臂、所述连接酶A的特异性识别序列的编码基因或所述内含肽A的编码基因，以及3
’
同源臂组成；所述5
’
同源臂为位于所述受体动物基因组中免疫球蛋白的所述编码基因A的所述位置A上游的120bp序列；所述3
’
同源臂为位于所述受体动物基因组中免疫球蛋白的所述编码基因A的所述位置A下游的150bp序列。
[0017]在本专利技术的具体实施方式中，所述5
’
同源臂为SEQ ID No.2的第1
‑
120位；所述3
’
同源臂为SEQ ID No.2的第157
‑
306位。
[0018]进一步地，所述连接酶A的特异性识别序列的编码基因为SEQ ID No.2的第133
‑
147位(所述连接酶A为Sortase A酶，SEQ ID No.2的第133
‑
147位为Sortase A酶的特异性识别序列的编码基因)。
[0019]更进一步地，所述DNA片段A的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0020]本专利技术所要求保护的脊椎动物模型的构建方法，具体可包括如下步骤：
[0021](1)将Cas9 mRNA、gRNA和前文所述的同源重组载体注射到所述受体动物的受精卵胞质中，得到F0代动物；
[0022]所述gRNA的序列为SEQ ID No.4。
[0023](2)将步骤(1)获得的所述F0代动物与所述受体动物进行杂交，从F1代动物中获得在基因组中所述免疫球蛋白的所述编码基因A的所述位置A处定点敲入所述连接酶A的特异性识别序列的编码基因或所述内含肽A的编码基因的杂合体动物。
[0024]进一步地，在步骤(2)之后，还可包括如下步骤(3)：
[0025](3)将雄性的所述杂合体动物与雌性的所述杂合体动物进行一次或多次杂交，从杂交后代中获得在基因组中所述免疫球蛋白的所述编码基因A的所述位置A处定点敲入所述连接酶A的特异性识别序列的编码基因或所述内含肽A的编码基因的纯合体本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种脊椎动物模型的构建方法，所述脊椎动物模型用于生产携带通用定点偶联接口的抗体；所述方法包括如下步骤：在受体动物的基因组中免疫球蛋白的某一编码基因A的某一位置A处定点敲入某种连接酶A的特异性识别序列的编码基因或者某种内含肽A的编码基因，得到所述脊椎动物模型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码基因A为Igkc基因，所述位置A为Igkc基因的3
’
端；和/或所述脊椎动物选自如下任一：小鼠、大鼠、兔、羊、鸡、骆驼、马、驴、仓鼠、豚鼠、羊驼。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述脊椎动物为小鼠；所述编码基因A为小鼠基因组中6号染色体上的Igkc基因，所述位置A位于小鼠基因组中6号染色体上的Igkc基因的第70726754和第70726755位之间。4.根据权利要求1
‑
3中任一所述的方法，其特征在于：所述连接酶A可选自如下任一：Sortase
staph
酶、Sortase
strep
酶、Butelase酶、oaAEP1酶、Formylglycine生成酶、谷胺酰转氨酶、微管蛋白酪氨酸连接酶、Trypsiligase、Sfp phosphopantetheinyl转移酶、SpyLigase；和/或当所述连接酶A为Sortase
staph A酶时，所述特异性识别序列为LPXTG，X为任意氨基酸；当所述连接酶A为Sortase
strep
酶时，所述特异性识别序列为LPXTA，X为任意氨基酸；当所述连接酶A为Butelase酶时，所述特异性识别序列为NHV；当所述连接酶A为oaAEP1酶时，所述特异性识别序列为NGL；当所述连接酶A为Formylglycine生成酶时，所述特异性识别序列为CXPXR，X为任意氨基酸；当所述连接酶A为谷胺酰转氨酶时，所述特异性识别序列为LLQGA；当所述连接酶A为微管蛋白酪氨酸连接酶时，所述特异性识别序列为VDSVEGEEEGEE；当所述连接酶A为Trypsiligase时，所述特异性识别序列为YRH；当所述连接酶A为Sfp phosphopantetheinyl转移酶时，所述特异性识别序列为DSLEFIASKLA；当所述连接酶A为Sfp phosphopantetheinyl转移酶时，所述特异性识别序列为DSLEFIASKLA；当所述连接酶A为SpyLigase时，所述特异性识别序列为AHIVMVDAYKPTK或ATHIKFSKRD。5.根据权利要求1
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4中任一所述的方法，其特征在于：所述定点敲入是利用CRISPR/Cas9技术实现的；进一步地，作为被Cas9核酸酶切割的靶序列位于所述受体动物的基因组中免疫球蛋白的所...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈韬，岳斌，吕爽，张伟，
申请(专利权)人：苏州有诺真生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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