一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法技术

本发明专利技术提供从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，根据以下步骤进行：首先用离心机离心除去样品中的大颗粒杂质，再通过分子筛层析柱对样品进行纯化，除去非外泌体大囊泡和大部分杂蛋白，将得到的外泌体馏分合并通过离子柱层析洗脱浓缩的外泌体，外泌体经过超滤换液提取到高纯度稳定的外泌体。本发明专利技术提供分子筛预装柱和浓缩柱料实现快速大规模提取高纯度外泌体的方法，通过该外泌体制备方法可以得到优于市面纯度的外泌体，且外泌体活性高，浓度大，既可应用于科研实验的小规模样品外泌体提取，也可放大应用于工业化规模的外泌体提取，方便下游的各种外泌体研究和临床医学使用。使用。使用。

【技术实现步骤摘要】
一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法


[0001]本专利技术涉及医学检验领域，具体为一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法。

技术介绍

[0002]外泌体是生物体液分泌的一种外囊泡亚型，天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体在细胞间的递送领域发挥着重要的作用，今年来对外泌体递送药物研究越来越频繁，外泌体递送药物到指定的细胞对医学领域起到重要的研究意义。现有技术中，提取外泌体的金标准是超速离心法，通过使用超速离心设备将细胞内的外泌体进行分离，但是该方法对设备要求高，增加了设备成本需求，且提取时间长。因此普通实验室难以满足对外泌体的提取过程。

技术实现思路

[0003]针对现有技术存在的不足，本专利技术目的是提供一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题,本专利技术即保证了高纯度，也减少了外泌体提取的时间，对设备要求不高，为临床应用，科研实验提供帮助。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，包括以下步骤：
[0005](1)待提取的含外泌体样本经过离心除去大颗粒、细胞碎片；
[0006](2)将上述样本加入到凝胶过滤分子筛层析柱中，收集外泌体馏分；
[0007](3)馏分合并加入平衡缓冲液；
[0008](4)通过离心方法除去Q阴离子树脂保存液，用平衡缓冲液重悬；
[0009](5)将馏分体系加入到Q阴离子树脂中，使外泌体与树脂结合；
[0010](6)用洗涤液洗涤Q阴离子树脂；
[0011](7)利用高浓度盐洗脱外泌体，外泌体经过超滤换液得到稳定外泌体。
[0012]进一步的，样本为终浓度0.5％
‑
5％硫酸链霉素处理的细胞上清，血清，血浆，尿液，牛奶，精液，唾液。样本离心为3500g，4℃离心20
‑
30min，弃沉淀，留取上清。血清血浆样本离心为12000g，4℃离心10
‑
20min，弃沉淀，留取上清。
[0013]进一步的，硫酸链霉素在4℃搅拌20
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30min，转速300rmp/min.血清血浆样本在摇床上摇晃20
‑
30min。凝胶过滤分子筛填料孔径30
‑
150nm，柱高10
‑
15cm。外泌体收集馏分为馏分4，馏分5，馏分6，每个馏分0.5ml。
[0014]进一步的，平衡缓冲液为Tris
‑
hcl缓冲液，tris浓度为20mM
‑
200mM，PH 7.5
‑
9.0。0.01M
‑
0.1M的磷酸盐缓冲液，PH 6.5
‑
8.0。
[0015]进一步的，平衡液与馏分混合时间为5
‑
10min，并在室温下进行。
[0016]进一步的，所述清洗液为Tris
‑
hcl缓冲液，tris浓度为20mM
‑
200mM，Nacl 50mM
‑
500mM，PH 7.5
‑
9.0。0.01M
‑
0.1M的磷酸盐缓冲液，Nacl 50mM
‑
500mM，PH 6.5
‑
8.0。
[0017]进一步的，结合树脂为弱阴离子树脂或者强阴离子树脂，弱阴离子树脂在PH6.0
‑
8.5，5mM
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50mMTris,0.01mM
‑
0.1mM磷酸盐条件下结合目标分子。
[0018]进一步的，强阴离子树脂在PH6.0
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8.0，5mM
‑
50mMTris,0.01mM
‑
0.1mM磷酸盐条件下结合目标分子。
[0019]进一步的，结合树脂与馏分的结合时间为20min，3500g在4℃离心2min。所述外泌体与树脂的结合的体积为0.1ml
‑
1ml。所述洗涤液为10
‑
100mM tris，PH6.5
‑
9.0。0.01M
‑
0.1M磷酸盐缓冲液，PH 6.3
‑
7.5.洗涤液洗涤体积100ul
‑
1mL。
[0020]进一步的，所述洗脱液为10
‑
100mM tris,Nacl 100mM
‑
500mM，Kcl 50mM
‑
200mM，PH6.5
‑
9.0。0.01M
‑
0.1M磷酸盐缓冲液，Nacl 100mM
‑
500mM，Kcl 50mM
‑
200mM，PH 6.3
‑
7.5。
[0021]进一步的，洗涤液洗涤体积100ul
‑
200ul。超滤管规格为100KD
‑
300KD，体积0.5ml
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1ml。超滤体积为100ul
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400ul.超滤离心力2000g
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3500g，5
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20min。
[0022]本专利技术的有益效果：
[0023]1.该从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法可应用于科研实验的小规模样品外泌体提取，也可放大应用于工业化规模的外泌体提取，方便下游的各种外泌体研究和临床医学使用。
[0024]2.该从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法解决大批量工业化细胞上清、尿液等生物样本提取外泌体的难题，提高外泌体的纯度与浓度，同时还可以解决小量血清，血浆样本的外泌体提取，同时提供了分子筛预装柱和浓缩柱料实现快速大规模提取高纯度外泌体的方法。
附图说明
[0025]图1为本专利技术一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法的流程图；
[0026]图2为本专利技术凝胶过滤纯化细胞上清外泌体BCA蛋白鉴定图；
[0027]图3为本专利技术阴离子柱料纯化细胞上清外泌体凝胶过滤馏分WB鉴定图；
[0028]图4为本专利技术阴离子柱料纯化细胞上清外泌体凝胶过滤馏分NTA鉴定图；
[0029]图5为本专利技术阴离子柱料纯化细胞上清外泌体凝胶过滤馏分电镜鉴定图；
[0030]图6为本专利技术凝胶过滤纯化人血清BCA蛋白鉴定图；
[0031]图7为本专利技术人血浆外泌体标志蛋白WB鉴定图；
[0032]图8为本专利技术阴离子柱料纯化人血清外泌体凝胶过滤馏分NTA鉴定图；
[0033]图9为本专利技术阴离子柱料纯化人血清外泌体凝胶过滤馏分电镜鉴定图。
具体实施方式
[0034]为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)待提取的含外泌体样本经过离心除去大颗粒、细胞碎片；(2)将上述样本加入到凝胶过滤分子筛层析柱中，收集外泌体馏分；(3)馏分合并加入平衡缓冲液；(4)通过离心方法除去Q阴离子树脂保存液，用平衡缓冲液重悬；(5)将馏分体系加入到Q阴离子树脂中，使外泌体与树脂结合；(6)用洗涤液洗涤Q阴离子树脂；(7)利用高浓度盐洗脱外泌体，外泌体经过超滤换液得到稳定外泌体。2.根据权利要求1所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：样本为终浓度0.5％
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5％硫酸链霉素处理的细胞上清，血清，血浆，尿液，牛奶，精液，唾液。样本离心为3500g，4℃离心20
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30min，弃沉淀，留取上清。血清血浆样本离心为12000g，4℃离心10
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20min，弃沉淀，留取上清。3.根据权利要求2所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：硫酸链霉素在4℃搅拌20
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30min，转速300rmp/min.血清血浆样本在摇床上摇晃20
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30min。凝胶过滤分子筛填料孔径30
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150nm，柱高10
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15cm。外泌体收集馏分为馏分4，馏分5，馏分6，每个馏分0.5ml。4.根据权利要求1所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：平衡缓冲液为Tris
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hcl缓冲液，tris浓度为20mM
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200mM，PH 7.5
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9.0。0.01M
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0.1M的磷酸盐缓冲液，PH 6.5
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8.0。5.根据权利要求4所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：平衡液与馏分混合时间为5
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10min，并在室温下进行。6.根据权利要求1所述的一种从细胞上生物体液中提取高纯度外泌体制备方法，其特征在于：所述清洗液为Tris
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hcl缓冲液，tris浓度为20mM
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200mM，Nacl 50mM
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500mM，PH 7.5
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9.0。0.01M
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0.1M的磷酸盐缓冲液，Nacl 50mM
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【专利技术属性】
技术研发人员：李立，吴笛笛，陈佳佳，高强，刘丕菊，甘宁，
申请(专利权)人：多莱泌生物科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：