基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统及其制备方法和应用技术方案

基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统及其制备方法和应用，属于医药技术领域，具体公开了采用了益生菌Escherichia coli Nissle 1917来源的细菌外膜囊泡包载二氧化锰纳米酶，制备成纳米益生菌体。细胞实验显示，该纳米益生菌体能清除细胞内过量的活性氧，同时并未对细胞造成损伤。进一步动物试验证实，该纳米益生菌体可以黏附于炎症的结肠上皮并有效清除肠道过量的ROS。此外，与抗炎药二甲双胍联用后还可以重塑促炎微环境，提高肠道菌群的丰富性和多样性，比市售IBD药物具有更好的疗效。本发明专利技术制备的纳米益生菌体能够显著治疗IBD，并具有良好的安全性，有望开发为治疗IBD和其他胃肠道疾病的药物。和其他胃肠道疾病的药物。和其他胃肠道疾病的药物。

【技术实现步骤摘要】
基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于医药
，涉及载药纳米粒，具体涉及一种基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的制备，以及其在抗炎性肠炎方面的应用。

技术介绍

[0002]炎症性肠病(IBD)，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是一种典型的胃肠道慢性炎症性疾病。其发病机制与肠道氧化应激、肠道菌群失调、促炎微环境失调密切相关。传统的医学IBD治疗集中于抑制系统免疫系统，引起脱靶的副作用，增加感染的风险。因此，临床迫切需要有效治疗IBD的方式。
[0003]肠道微生物群的失调是IBD的一个重要标志，这表明肠道微生物群的重塑可能会缓解IBD。有一些证据表明，将益生菌移植到患病动物的肠道中可以缓解这种疾病，而微生物物种的多样性对健康有直接影响。这一理论最成功的应用之一是使用粪便微生物群移植(FMT)治愈复发性艰难梭菌感染。这种以细菌为基础的生物疗法在临床已被证明可以减轻肠道感染。然而，FMT可能导致侵袭性多药耐药微生物传播的潜在风险，并可能产生严重的不良反应。这一在FMT中暴露的安全问题揭示了当前细菌介导的生物治疗的困境。
[0004]益生菌衍生的外膜囊泡(OMVs)，自然来源于革兰氏阴性菌，具有直径为20
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400nm的双脂层。OMVs由多个生物分子组成，如蛋白质、脂质和细菌特异性抗原，在解毒、基因传递和细菌
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细菌通信中发挥重要作用。具有解毒成分和易于大规模生产的OMVs被认为是生物医学应用的细菌替代品。一方面，在澳大利亚，益生菌EcN作为的主要成分，已作为一种注册的补充药物，用于临床缓解和管理慢性便秘。另一方面，据报道由幽门螺杆菌衍生的OMVs包裹的聚(乳酸共乙醇酸)纳米颗粒继承了天然的细菌粘附素，以阻断幽门螺杆菌与胃上皮细胞的结合。它们作为致病性幽门螺杆菌的竞争对手，减少了幽门螺杆菌对小鼠胃的粘附。该安全有效的平台为IBD和其他胃肠道疾病提供有效的治疗途径。
[0005]经文献检索等，迄今为止，尚未发现有益生菌Escherichia coli Nissle 1917的OMVs制备包被二氧化锰的OMVs载药系统，并进行IBD及其他胃肠道疾病研究的相关报道。
[0006]基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种益生菌衍生的外膜囊泡包被纳米酶的制备及其用途，尤其是源于益生菌Escherichia coli Nissle 1917的外膜囊泡包载的二氧化锰纳米酶用于制备治疗IBD实例。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是基于现有技术的现状，提供一种基于工程化益生菌衍生外膜囊泡包被纳米酶递送及其制备方法，以及其在抗炎性肠炎方面的应用，尤其是源于益生菌Escherichia coli Nissle 1917的外膜囊泡包载二氧化锰纳米酶在制备治疗IBD的药物中的用途。
[0008]本专利技术从益生菌Escherichia coli Nissle 1917中分离细菌外膜囊泡，并采用该
囊泡包被二氧化锰纳米酶制备成纳米益生菌体，该纳米益生菌体易于富集在炎性肠道，能有效清除炎性肠道过表达的活性氧(ROS)，并竞争性抑制有害微生物群的黏附，调节肠道微生物群的相对丰度。本专利技术制备的纳米益生菌体可显著抑制小鼠肠道炎症，为IBD和其他胃肠道疾病提供有效的治疗途径。
[0009]更具体的，本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0010]基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统，其为以工程化益生菌外膜囊泡为载体，内部荷载纳米酶的纳米益生菌体。所述工程化益生菌外膜囊泡为工程化益生菌所分泌的细菌外膜囊泡，所述的工程化益生菌选自E.coli
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BL21、Escherichia coli Nissle 1917(简称E.coli
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1917)、E.coli
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K12、E.coli
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MG1655、E.coli
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TOP10、奥奈达希瓦氏菌MR
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1、减毒沙门氏菌VNP20009、蛭弧菌中的一种或多种。所述的被荷载于囊泡内部的纳米酶为可以清除ROS的功能性ROS清除酶，选自Pt、Ag、Cr、MnO2、FeCl3、CuO、Cr2O3、MnO2、Fe2O3、CoO、NiO、Cu2O、ZnO中的一种或多种。
[0011]所述纳米益生菌体的制备方法，包括如下步骤：
[0012]本专利技术采用超滤浓缩法和超速离心法从工程化益生菌培养液中分离OMVs；含有油酸的高锰酸钾乳液经过搅拌、离心、洗涤和真空冷冻干燥的步骤得到二氧化锰(MnO2)纳米花；选用脂质体挤出仪配合适当孔径的聚碳酸酯膜为挤出装置，将OMVs与MnO2混悬液挤出混合，将挤出液在4℃，6000g条件下离心20min，弃去上清液，收集底部沉淀即得所制备的纳米益生菌体。
[0013]所述制备方法，其中：
[0014]所述工程化益生菌优选Escherichia coli Nissle 1917。
[0015]所述OMVs与MnO2混悬液来回挤出10次。
[0016]本专利技术的纳米益生菌体的构建具体步骤参见具体实施方式中的实施例1。本专利技术以小鼠结肠癌细胞CT26为实验对象，结果表明在体外该纳米益生菌体能快速有效的消耗过氧化氢；此外该纳米益生菌体能够被小鼠结肠癌细胞摄取，缓解细胞内较高的氧化应激；然后本专利技术以雌性C57BL/6J小鼠(18
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22g)为实验对象，建立IBD小鼠模型，结果表明，纳米益生菌体能有效富集在炎性肠道部位。同时纳米益生菌体治疗组小鼠疾病指数得到显著改善，显著提高小鼠的生存率，并且能够快速使体重恢复至正常水平；此外，纳米益生菌体与抗炎药二甲双胍联用后还可以重塑促炎微环境，提高肠道菌群的丰富性和多样性，比市售炎症性肠病药物具有更好的疗效。体内外安全性评价表明，该纳米粒无明显的毒副作用。本专利技术为IBD和其他胃肠道疾病提供一种全新的策略。
[0017]本专利技术还提供所述纳米益生菌体的如下应用：
[0018]所述纳米益生菌体在药物传递系统中的应用。
[0019]所述纳米益生菌体在治疗肠道性疾病药物中的应用。
[0020]所述纳米益生菌体在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
[0021]所述纳米益生菌体在缓解氧化应激微环境中的应用。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的纳米益生菌体具有以下优点：
[0023]1)益生菌Escherichia coli Nissle 1917衍生的OMVs包裹了具有ROS清除能力的二氧化锰(MnO2)纳米酶，可以有效延长肠道滞留时间，缓解炎性部位的氧化应激。
[0024]2)抗炎二甲双胍与纳米益生菌体相结合，可以重塑促炎微环境，增加肠道微生物
群的丰富度和多样性。
[0025]3)联合治疗比市售IBD药物具有更好的治疗效果。重要的是，在这种治疗中没有发现明显的全身毒性。
附图说本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统，其特征在于，其为以工程化益生菌外膜囊泡为载体，内部荷载纳米酶的纳米益生菌体。2.根据权利要求1所述的基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统，其特征在于，所述工程化益生菌外膜囊泡为工程化益生菌所分泌的细菌外膜囊泡，所述的工程化益生菌选自E.coli
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BL21、E.coli
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1917、E.coli
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K12、E.coli
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MG1655、E.coli
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TOP10、奥奈达希瓦氏菌MR
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1、减毒沙门氏菌VNP20009、蛭弧菌中的一种或多种；所述的被荷载于囊泡内部的纳米酶为可以清除ROS的功能性ROS清除酶，选自Pt、Ag、Cr、MnO2、FeCl3、CuO、Cr2O3、MnO2、Fe2O3、CoO、NiO、Cu2O、ZnO中的一种或多种。3.一种权利要求1或2所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备纳米益生菌体：益生菌接种培养，菌体OD值达到1.0后收集菌液；离心除去菌体后，超滤浓缩法和超速离心制备OMVs，
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20℃分...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙孟驰，孙进，李吉威，刘林林，杨伟光，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：