一种香蕉原生质体的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种香蕉原生质体的制备方法和应用，属于植物原生质体技术领域。本发明专利技术采用香蕉吸芽的内层组织，改进酶解溶液配方，通过多次低速离心与重悬的方法，获得高纯度香蕉原生质体，达到每克组织1.22

【技术实现步骤摘要】
一种香蕉原生质体的制备方法和应用


[0001]本专利技术属于植物原生质体
，具体涉及一种香蕉原生质体的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]植物原生质体作为一种理想的遗传转化受体，利用植物原生质体进行瞬时表达是分析分子遗传研究中开展如基因表达、亚细胞定位、蛋白质相互作用、启动子活性等分析的重要技术手段。目前，在包括模式物种在内的众多物种中均有成功的原生质体转化体系的报道。对于香蕉来说，胚性细胞悬浮系、愈伤组织都被认为是很好的原生质体分离材料，但对于从香蕉植物组织中直接分离得到有活力的原生质体确鲜有报道。
[0003]香蕉作为世界第二大水果，其种植面积与产量仅次于柑橘，是热带及亚热带地区重要的经济和粮食作物之一。目前香蕉的常用栽培品种抗性差，常遭受到土传病害尤其是香蕉枯萎病的严重侵害。因大多数香蕉栽培品种属于无性繁殖且由于自身的多倍性与高度不育性，使其遗传多样性丧失，造成传统育种方法难以实施等的问题。因此，亟需利用新的技术体系选育出优质的香蕉新品种，使香蕉产业健康持续的发展是当前的重任。利用香蕉原生质体分离转化体系和原生质体融合技术有可能解决香蕉传统育种难的问题，加速获得新品种。完善香蕉原生质体瞬时表达体系，也可为后续对香蕉的功能基因组研究提供一种良好的研究技术手段，进一步为香蕉的抗病育种研究奠定了基础。因此，构建高效稳定的原生质体制备及瞬时转化方法对于香蕉遗传研究和育种利用有重要意义。

技术实现思路

[0004]针对上述技术问题，本专利技术提供了一种香蕉原生质体的制备方法和应用，解决了直接从香蕉植物组织中直接分离得到有活力的原生质体以及难以开展遗传转化工作的难题，为香蕉蛋白质亚细胞定位、启动子功能验证等分子遗传学研究提供一种稳定高效的技术方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种香蕉原生质体的制备方法包括以下步骤：（1）采集香蕉吸芽，逐层剥离后得到内层幼嫩部分，将其切为0.5
‑
1mm吸芽小段；（2）将吸芽小段浸泡到含有0.6 M甘露醇的培养皿中，用锡箔纸密封培养皿，静置5 min；（3）用移液枪吸净甘露醇后，将吸芽小段移至50 mL烧杯，加入5 mL酶解液，在真空泵中抽真空2
‑
3次，每次5 min；（4）用锡箔纸密封烧杯，50 rpm水平振荡，室温下（26℃）酶解至原生质体从吸芽小段上解离；（5）酶解完成后，用200目的细胞筛将酶解液过滤至50 mL离心管中，并用冰上预冷的W5溶液多次冲洗小烧杯，并过滤至50 mL离心管中；
（6）将步骤（5）过滤后的溶液在400 g（缓慢升降速）转速下离心3 min，弃上清液；再缓慢加入15 mL预冷的W5溶液，轻柔重悬细胞，在400 g转速下再次离心3 min，后吸去多余上清液；（7）将步骤（6）重复2次，将最后一次离心获得的原生质体重悬于15 mL预冷的W5溶液中，置于4℃冰箱中预冷30 min后，在400 g转速下离心3 min，弃上清液；（8）再加入适量的MMG溶液，将细胞沉淀重悬充分后以备用。
[0006]优选的，所述步骤（4）中酶解时间为6 h。
[0007]优选的，所述酶解液的组分及其含量如下：10 mM MES pH 7.5、0.6 M D
‑
Mannitol、2.5%（w/v）纤维素酶（Cellulase R
‑
10）、1%（w/v）离析酶（Macerozyme R
‑
10）、10 mM CaCl2、0.1%（w/v）BSA、0.35%（v/v）2
‑
巯基乙醇（β
‑
Mercaptoethanol）。
[0008]优选的，所述W5溶液中的组分及其含量如下：1.5 mM MES pH 7.5、155 mM NaCl、125 mM CaCl2、5 mM KCl、5 mM D
‑
(+)
‑
Glucose。
[0009]优选的，所述MMG溶液中的组分及其含量如下：4mM MES pH 7.5、0.6 M D
‑
Mannitol、10 mM MgCl2·
6H2O。
[0010]本专利技术制得的香蕉原生质体可用于遗传转化、香蕉蛋白质亚细胞定位、香蕉育种。
[0011]有益效果：（1）本专利技术可以获得高达每克组织1.22
×
107个原生质体，有效解决了从香蕉植物组织中直接分离得到有活力的原生质体的难题。同时，优化了配套转化体系，使得转化效率达到75%以上。
[0012]（2）本专利技术为香蕉蛋白质亚细胞定位、启动子功能验证等分子遗传学研究提供了有效的研究技术手段。从技术角度而言，本专利技术通过简单易行且具有创新性的多处技术工艺改进实现，降低操作难度，因此更加凸显其推广应用价值和商业开发潜力。
附图说明
[0013]图1是香蕉扩繁幼苗（A）、生根幼苗（C）和吸芽（E）示意图，其中图E左图为完整的香蕉吸芽，右图为外层剥离后的香蕉吸芽幼嫩部分；Bar=1 cm；图B、D和F分别是香蕉扩繁幼苗、生根幼苗和吸芽在不同酶解液条件下酶解8小时的原生质体产量图；图2是香蕉吸芽在不同酶解时间下分离的原生质体产量图；图3是质粒35S::YFP在香蕉原生质体中转化后的表达效果图，其中左图为GFP场，中图为明场，右图为合并场；Bar=50 μm。
具体实施方式
[0014]本专利技术所用试剂耗材如下：MES (Sigma，V900336
‑
500G)KCl (西陇科学股份有限公司)MgCl2•
6H2O (Sigma，M2393
‑
500G)CaCl
2 (Sigma，C4901
‑
500G)PEG4000 (Sigma，81240
‑
1KG)NaCl (西陇科学股份有限公司)
D
‑
Mannitol (Sigma，M1902
‑
1kg)Cellulase R
‑
10 (Yakult，L0012)Macerozyme R
‑
10 (Yakult，JM6033)Pectinase Y
‑
23 (Yakult, P8220
‑
100)D
‑
(+)
‑
Glucose（Sigma，G8270
‑
1KG）BSA (兰博利德生物技术有限公司)β
‑
ME (Sigma，M3148)下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步描述。
[0015]下述实施例中各溶液的配置如下：（1）酶解溶液的配制方法为：将39.048 g MES溶解到1 L的蒸馏水中，并用KOH调pH值到7.5，得到0.2 M MES pH7.5母液，4℃黑暗保存；将146.536 g D
‑
Mannitol溶解到1 L的蒸馏水中，得到0.8 M D...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种香蕉原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）采集香蕉吸芽，逐层剥离后得到内层幼嫩部分，将其切为0.5
‑
1 mm小段；（2）将吸芽小段浸泡到含有0.6 M甘露醇的培养皿中，用锡箔纸密封培养皿，静置5 min；（3）用移液枪吸净甘露醇后，将吸芽小段移至烧杯，加入5 mL酶解液，在真空泵中抽真空2
‑
3次，每次5 min；（4）用锡箔纸密封烧杯，50 rpm水平振荡，室温下酶解6小时至原生质体从吸芽小段上解离；（5）酶解完成后，用200目的细胞筛将酶解液过滤至离心管中，并用冰上预冷的W5溶液多次冲洗烧杯，并过滤至离心管中；（6）将步骤（5）过滤后的溶液离心3 min，弃上清液；再缓慢加入15 mL预冷的W5溶液，轻柔重悬细胞，再次离心3 min，后吸去多余上清液；（7）将步骤（6）重复2次，将最后一次离心获得的原生质体重悬于15mL预冷的W5溶液中，置于4℃冰箱中预冷30 min后，离心3 min，弃上清液；（8）再加入MMG溶液，将细胞沉淀重悬充分后以备用。2.根据权利要求1所述的香蕉原生质体的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔海涛，赵春慧，付岗，王衍坤，李舒宇，杨迪，高辉，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：