用于进行提高谷氨酰胺生产力的转化的重组载体和使用其的菌株制造技术

本发明专利技术涉及由于通过载体进行转化而具有提高的谷氨酰胺生产力的菌株，所述载体包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列。成酶的核苷酸序列。成酶的核苷酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于进行提高谷氨酰胺生产力的转化的重组载体和使用其的菌株


[0001]本专利技术涉及用于进行提高谷氨酰胺生产力的转化的重组载体，以及引入了该重组载体的菌株。

技术介绍

[0002]谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)的活性由谷氨酰胺合成酶腺苷酸转移酶(glutamine synthetase adenylyltransferase，ATase，glnE)调节。ATase通过催化GS的腺苷酸化和脱腺苷酸化来调节GS的活性，并受到培养基中氮浓度的影响。ATase的活性受PII(氮调节蛋白P
‑
II基因，glnB)的调节。图1示出了这样的机制：其中当氮浓度高时，GS的活性受到PII和ATase活化的抑制。因此，当供应氮源来产生谷氨酰胺时，会出现这样的问题：GS的活性受到所供应的氮源反馈抑制，从而导致谷氨酰胺产量降低。
[0003]因此，为了提高谷氨酰胺产生的效率，需要抑制由ATase引起的对GS的反馈抑制。日本专利No.JP4898441公开了这样的菌株：在所述菌株中，通过抑制参与GS活性抑制的glnB和glnE基因的活性来提高谷氨酰胺产生，但仍有改进的空间。
[0004][现有技术文献][0005](专利文献0001)日本专利No.JP 4898441 B2(2012年1月6日)
[0006]公开内容
[0007]技术问题
[0008]一个实施方案提供了产生谷氨酰胺的菌株，其包含含有编码由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列的载体。
[0009]技术方案
[0010]一个方面提供了用于进行转化的载体，其含有编码由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列。
[0011]谷氨酰胺合成酶是由谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。由于由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的谷氨酰胺合成酶的活性受ATase抑制的程度低于由另一序列组成的谷氨酰胺合成酶的活性受ATase抑制的程度，因此具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的谷氨酰胺合成酶可提高谷氨酰胺生产力。
[0012]根据一个实施方案，编码谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列可由SEQ ID NO：2的核苷酸序列组成。
[0013]根据一个实施方案，由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的谷氨酰胺合成酶和由SEQ ID NO：2的核苷酸序列组成的glnA基因可源自以登记号KFCC10694保藏的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株。根据一个实施方案，作为比较源自KFCC10694的glnA序列与源自另一谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032的glnA序列之间的同源性的结果，确定了核苷酸序列同源性仅为88.2％，并且由所述基因表达的谷氨酰胺合成酶之间的氨基酸序列同源性仅为93.7％。由于这种序列差异，源自KFCC10694的谷氨酰胺合成酶的活性受ATase
for General Bacteriology,American Society for Bacteriology,Washington D.C.,USA,1981)。此外，培养基可包含多种碳源、氮源和微量元素组分。可使用的碳源的一些实例包括：糖类和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油和乙醇；以及有机酸，例如乙酸。这些物质可单独使用或作为混合物使用。可使用的氮源的一些实例包括蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉、尿素，或者无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可单独使用或作为混合物使用。可使用的磷源的一些实例包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、或者相应的含钠盐。培养基可包含生长所需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。另外，培养基可包含必需的生长物质，例如氨基酸和维生素。此外，可在培养基中使用合适的前体。可在培养期间将培养基或单独的组分通过合适的方法分批或以连续方式添加至培养基中。
[0030]培养基的pH可通过在培养期间以适当方式向微生物培养基中添加化合物例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸来调节。另外，在培养期间，可使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制发泡。另外，为了将培养基保持在有氧条件下，可将氧气或含氧气体(例如，空气)注入培养基中。培养基的温度通常可以是20℃至45℃，例如25℃至40℃。可继续培养直至产生所期望量的L
‑
谷氨酰胺。例如，培养时间可以是10小时至160小时。
[0031]用于产生谷氨酰胺的方法可包括从所培养的微生物或培养基中回收L
‑
谷氨酰胺的步骤。用于回收L
‑
谷氨酰胺的方法没有特别限制，并且可以根据培养方法使用本领域中已知的适当方法回收L
‑
谷氨酰胺。用于回收L
‑
谷氨酰胺的方法的一些实例包括离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等。
[0032]有益效果
[0033]由于根据一个实施方案的菌株表达的谷氨酰胺合成酶较少地受到ATase反馈抑制，因此其可显著提高谷氨酰胺产量。
附图说明
[0034]图1示出了其中谷氨酰胺合成酶的活性受调节的机制。
[0035]图2示出了根据一个实施方案的pk19ms/
△
glnA载体。
[0036]图3示出了根据一个实施方案的pk19ms/
△
glnE载体。
[0037]图4示出了根据一个实施方案的pa
’‑
glnA(ATCC13032)载体。
[0038]图5示出了根据一个实施方案的pa
’‑
glnA(KFCC10694)载体。
[0039]专利技术实施方式
[0040]在下文中，将参考实施例更详细地描述一个或更多个实施方案。然而，这些实施例用于举例说明一个或更多个实施方案，并且本专利技术的范围不限于这些实施例。
[0041]实施例1：用于使KFCC
‑
10694染色体上glnA和glnE基因缺失的载体的构建
[0042]作为用于载体构建的材料，使用了Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega，USA)、PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara，Japan)、DNA连接试剂盒(Takara，Japan)以及HindIII和BamHI(NEB，England)。
[0043]1‑
1.用于使glnA缺失的载体的构建
[0044]使用KFCC
‑
10694菌株(谷氨酸棒状杆菌MWM
‑
891020)的染色体DNA作为模板，用引
物1和引物2进行PCR以获得KFCC
‑
10694的glnA左臂的扩增产物。类似地，用引物3和引物4进行PCR以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于进行转化的载体，其含有编码由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列。2.权利要求1所述的载体，其中编码所述谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列由SEQ ID NO:2组成。3.权利要求1所述的载体，其含有与编码所述谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列可操作地连接的启动子。4.权利要求1所述的载体，其含有与编码所述谷氨酰胺合成酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪寅杓，金奉基，崔珉溍，朴硕贤，韩载春，
申请(专利权)人：大象株式会社，
类型：发明
国别省市：