双特异性磷酸酶14（Dusp14）在耳聋中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双特异性磷酸酶14(DUSP14)在治疗耳聋中的功能及应用，属于基因的功能与应用领域。本发明专利技术确定了DUSP14的表达与听觉器官之间的相互关系，研究结果表明在发生听觉器官的模型中，DUSP14的表达和正常组相比显著降低；DUSP14显著抑制了听觉器官的恶化。因此，DUSP14可作为靶基因，用于筛选保护听觉器官、和/或预防、缓解和/或治疗耳聋的药物，用于制备保护耳部的听觉器官功能、和/或预防、缓解和/或治疗耳聋的药物，为耳聋的治疗提供了一条有效的新途径。了一条有效的新途径。了一条有效的新途径。

【技术实现步骤摘要】
through inactivation of TAK1
‑
P38MAPK/
‑
JNK1/2signaling pathway.Basic research in cardiology.2016；111(2):19。

技术实现思路

[0009]本专利技术针对上述现有的问题的一个或多个，本专利技术的目的在于确定Dusp14基因的表达与耳聋之间的相互关系，提供一种用于耳聋的靶基因Dusp14的新应用，即Dusp14作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗耳聋的药物中的应用，以及Dusp14在制备用于预防、缓解和/或治疗耳聋的药物中的应用，进而把Dusp14基因应用于耳聋的治疗。
[0010]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0011]本专利技术以耳聋细胞Dusp14基因突变型斑马鱼和Dusp14野生型斑马鱼为实验对象，通过CRISPR/Cas9技术构建耳聋模型研究Dusp14基因的功能。结果表明：与Dusp14野生型斑马鱼相比，Dusp14基因突变型斑马鱼耳部毛细胞的发育均显著异常，发生退化；与Dusp14基因突变型斑马鱼相比，Dusp14野生型斑马鱼的毛细胞、半规管、耳石的发育明显退化程度减小。这提示Dusp14基因具有保护耳部毛细胞的作用，为研究Dusp14在防治耳聋疾病的新靶点和新策略中所发挥的作用提供了理论依据和临床基础。
[0012]本专利技术的研究证明了：在耳聋模型模型中，Dusp14具有抑制耳朵毛细胞坏死、减少毛细胞凋亡、保护耳功能的作用。
[0013]一种Dusp14基因在耳聋毛细胞中的功能，主要体现在Dusp14具有保护耳部毛细胞功能的作用，特别是Dusp14具有改善耳聋的作用。
[0014]针对Dusp14改善耳聋的功能，Dusp14具有如下应用：
[0015]Dusp14作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗耳聋的药物中的应用。该应用是非诊断和治疗的目的；所述的筛选预防、缓解和/或治疗耳聋的药物，是指筛选够促进Dusp14表达的药物。
[0016]Dusp14在制备预防、缓解和/或治疗耳聋的药物中的应用。
[0017]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0018](1)本专利技术发现Dusp14基因的新功能，即Dusp14基因能够抑制耳部毛细胞损伤，且与耳部毛细胞凋亡密切相关。
[0019](2)基于Dusp14在抑制耳聋疾病中的作用，其可以用于筛选或制备预防、缓解和/或治疗耳聋的药物。
附图说明
[0020]图1为临床发现的耳聋病患者家系图谱；
[0021]图2为Dusp14基因突变斑马鱼听觉器官发育受到损伤的示例图片。
具体实施方式
[0022]下面结合附图对申请技术方案作进一步详细说明。
[0023]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员
在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0024]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0025]下面结合附图，对本专利技术的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特性可以相互组合。
[0026]实验用动物及饲养：
[0027]实验动物：选用野生的斑马鱼(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)、Dusp14基因突变型斑马鱼(Dusp14
‑
KO)(由南通大学动物实验中心魏官云老师实验室构建)为实验对象。
[0028]饲养环境：所有实验斑马鱼均饲养在南通大学SPF级实验动物中心。SRF级小鼠饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司。饲养条件：室温在5
‑
10℃之间，湿度在40
‑
70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
[0029]一、在临床中发现家族耳聋病例(图1)，对该家族成员进行外显子测序和分析，发现Dusp14基因上的一个突变位点(c.328C>G，p.H110D)与该家族中耳聋患者间有高度相关性。
[0030]1.样本准备：临床发现一个后天性耳聋病家族，提取该家系中耳聋病人血液样本(实验组，10人)和非耳聋个体血液样本(14人)，用trizol法提取各样本的总RNA，并保存于
‑
80℃待用。
[0031]2.利用全外显子组测序技术进行致病突变基因分析：对各样本进行外显子测序，测定仪器为HiSeq 2000测序仪(Illumina,San Diego,CA,USA)。所测序列与NCBI37/hg19数据库进行比对分析，鉴定SNP和DNA缺失位点，筛选候选致病突变基因，确定Dusp14基因上的一个突变位点与该家族中耳聋患者间有高度相关性。
[0032]二、利用动物模型验证Dusp14基因在听觉系统的表达。毛细胞听觉感知细胞，其损伤和减少等是感音神经性耳聋发生的最主要原因，通过全胚胎原位杂交(WISH)实验检测野生型AB系斑马鱼Dusp14的表达，发现Dusp14在毛细胞中高表达。
[0033]三、利用Dusp14突变体斑马鱼分析听觉器官的表型变化，激光共聚焦显微镜Time
‑
lapse技术活体记录胚胎听觉器官的发育过程及表型，分析与正常胚胎的差异，包括半规管的形态、耳石的形态、毛细胞的分布及数量等。证实Dusp14基因的突变可导致斑马鱼半规管发育异常断裂、耳石碎裂、毛细胞缺失等表型，进而听觉系统等功能受损。
[0034]如图所示，突变斑马鱼内耳毛细胞数量减少；A
’
统计表明突变斑马鱼内耳毛细胞数量显著减少；B.突变斑马鱼半规管断裂；C.突变斑马鱼耳石发育异常，包括耳石碎裂、融合及多耳石，核苷酸序列SEQ:2所示的Dusp14基因突变体序列在制备耳聋疾病诊断试剂中的应用，特别是耳聋的早期诊断，Dusp14片段特异性扩增的上游引物序列如SEQ:3所示，下游引物序列如SEQ:4所示，其相应测序引物序列如SEQ:5所示。此外，本专利技术提供一种常染色体显性非综合征型耳聋诊断基因芯片，具有检测SEQ:2所示核苷酸序列的Dusp14基因突变体的探针。所述探针序列如SEQ:6和SEQ:7所示
[0035]本专利技术所提供的常染色体显性非综合征型耳聋Dusp14基因突变体，突变位点是：
Dusp14基因SEQ:1编码区第328位核苷酸C突变为G(c.328C>G，p.H110D)，为杂合子。序列分析表明该位置缺失突变引起Dusp14基因编码蛋白发生氨基酸突本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Dusp14作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗耳聋的药物中的应用，其特征在于：所述的应用是非诊断和治疗的目的；所述的筛选预防、缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏官云，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：