一种快速提取FFPE样本中DNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种快速提取FFPE样本中DNA的提取方法，涉及核酸提取技术技术领域，本发明专利技术将二甲苯替换为十六烷异构体，无色无味无毒，同时不影响提取效果，其次，创新的加入UNG酶，选择性断裂单链和双链DNA中U碱基的糖苷键，降解反应体系中含U的DNA，有效消除环境中PCR产物的污染，降低低频发生的C>T|G>A转换(人为突变)，同时有效保留真实发生的突变，从而保证下游扩增的特异性和SNP位点检测的准确性；另外，加入二氧化硅包被的纳米磁性微球，并配合自动化提取仪器可实现FFPE样本中DNA的快速提取的效果。速提取的效果。速提取的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种快速提取FFPE样本中DNA的提取方法


[0001]本专利技术涉及核酸提取技术
，具体为一种快速提取FFPE样本中DNA的提取方法。

技术介绍

[0002]随着下一代测序在临床上的迅速应用，肿瘤学中的突变分析是癌症患者分层的关键，以便进行适当的分子靶向治疗，这就极大地增加了可操作突变检测的临床需求。福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织通常作为检测实体肿瘤中可操作突变的主要材料，这些组织是用于疾病研究的非常珍贵的资源，因此这些分析中使用的DNA提取产物必须是可以获得的最佳质量。但是这些组织通常在细胞中很难处理，由于样本保存时间、固定包埋条件、DNA
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蛋白质交联、抑制剂和DNA片段化等因素，从这些样品中提取的DNA在质量上可能差异很大，如果用于提取DNA的方法不佳可能导致突变或病毒存在位置与检测结果不一致，影响下游的基因组分析。
[0003]目前专利技术的提取FFPE样本中DNA的方法主要有临界点干燥法、蛋白酶K消化法和碱性/酸性溶液处理法等，本专利技术采用蛋白酶K消化法。传统的提取方法会使用二甲苯进行脱蜡，这就涉及到很多问题：第一，二甲苯是一种有刺激性气味的有毒试剂，属于三类致癌物质，对实验者的身体健康存在威胁；第二，二甲苯脱蜡后，极易造成核酸片段化，影响核酸的提取得率；第三，二甲苯的脱蜡效果不佳，如果石蜡组织切片较厚则难以渗透，对后续的裂解效果有影响。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种快速提取FFPE样本中DNA的提取方法，具备的将二甲苯替换为十六烷异构体，无色无味无毒，同时不影响提取效果；其次，创新的加入UNG酶，选择性断裂单链和双链DNA中U碱基的糖苷键，降解反应体系中含U的DNA，有效消除环境中PCR产物的污染，降低低频发生的C>T|G>A转换(人为突变)，同时有效保留真实发生的突变，从而保证下游扩增的特异性和SNP位点检测的准确性；另外，加入二氧化硅包被的纳米磁性微球，并配合自动化提取仪器可实现FFPE样本中DNA的快速提取的效果，解决了上述的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种快速提取FFPE样本中DNA的提取方法，包括以下几个步骤：
[0006](1)、将石蜡包埋的组织样本切成5～10μm的薄片，取4～5片置于1.5mL离心管中，加入160μL脱蜡剂Buffer DS，涡旋震荡10秒，再加入180μL裂解液1和20μL蛋白酶K，涡旋震荡10秒，12000rpm、25℃离心1分钟；
[0007](2)、将水浴锅或恒温混匀仪预热至56℃，孵育1小时直至样品完全溶解，然后90℃孵育1小时(等待升温的过程中需要取下样品)，孵育结束后置于离心机中12000rpm、25℃离心1分钟，用移液器沿管壁小心吸取下层水相(约180μL)于新的1.5mL离心管中，尽量避免吸入管底沉淀和上层蜡液；
[0008](3)、在离心管中加入7μL UNG(1U/μL)，50℃，5min，不震荡；
[0009](4)、待离心管内样品温度降至室温后，在离心管中加入2μL的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置2分钟；
[0010](5)、向离心管中加入20ul蛋白酶K，65℃、450rpm孵育15分钟；
[0011](6)、在放有水相层的离心管中加入异丙醇200uL混合均匀，室温反应10min；
[0012](7)、向离心管中加入200μL裂解液2，涡旋震荡混匀后加入300μL异丙醇与20μL磁珠，涡旋震荡彻底混匀，于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合10分钟，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，弃去溶液；
[0013](8)、向离心管中加入750μL漂洗液1(使用前请检查是否已加入无水乙醇)，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液，重复一次；
[0014](9)、向离心管中加入750μL漂洗液2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液，重复一次；
[0015](10)、离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，之后开盖室温放置5～10分钟使乙醇充分挥发，向离心管中加入50～200μL洗脱液后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后将离心管固定于56℃、1600rpm的恒温混匀上震荡洗脱10分钟；
[0016](11)、随后将离心管在室温或加热10～15min，加热温度范围是30～80℃，使磁珠和细胞组织表面的有机溶剂残留量降低；
[0017](12)、将离心管固定于磁力架上静置2分钟，所得上清即为核酸产物，可于
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20℃冰箱冻存。
[0018]可选的，所述(1)中裂解液1为Buffer GTL，含10～100mM Tris
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HCL、1～5M的盐酸胍、0.05～0.5M NaCL和10～50mM EDTA、0.1～10％Triton
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X及水等，pH6.5～8.5，所述裂解液1含50mM Tris
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HCL、3M的盐酸胍、0.1M NaCL和10mM EDTA、0.5％Triton X
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100，pH为7.5。
[0019]可选的，所述(1)中蛋白酶K的浓度为20mg/mL。
[0020]可选的，所述(3)中UNG为尿嘧啶
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N
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糖基化酶，通过大肠杆菌表达纯化的重组酶，具有45℃
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65℃的热启动温度。
[0021]可选的，所述(4)中RNase A的浓度为100mg/mL。
[0022]可选的，所述(6)中裂解液2为Buffer GL，含10～100mMTris
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HCL，1～10mM EDTA，1～10M的盐酸胍，10～100mM NaCl，0.1～5％Triton X
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100，0.1～5％Tween
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20等，pH6.5～8.5，所述裂解液2含50mMTris
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HCL，10mM EDTA，100mM NaCl，2M的盐酸胍，1％Triton X
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100，3％Tween
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20,pH为7.5。
[0023]可选的，所述(6)中磁珠为超顺磁微球，粒径介于10～50nm，悬浮液浓度为100mg/mL，pH为5.0。
[0024]可选的，所述(7)中漂洗液1为Buffer GW1，含：10～50mM Tris
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HCl，1～10mM EDTA，10～100mM NaCl和40～60％无水乙醇，pH6.0～7.0，所述漂洗液1含50mM Tris
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HCl，5mM EDTA，100mM NaCl本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速提取FFPE样本中DNA的提取方法，其特征在于，包括以下几个步骤：(1)、将石蜡包埋的组织样本切成5～10μm的薄片，取4～5片置于1.5mL离心管中，加入160μL脱蜡剂Buffer DS，涡旋震荡10秒，再加入180μL裂解液1和20μL蛋白酶K，涡旋震荡10秒，12000rpm、25℃离心1分钟；(2)、将水浴锅或恒温混匀仪预热至56℃，孵育1小时直至样品完全溶解，然后90℃孵育1小时，孵育结束后置于离心机中12000rpm、25℃离心1分钟，用移液器沿管壁小心吸取下层水相于新的1.5mL离心管中，尽量避免吸入管底沉淀和上层蜡液；(3)、在离心管中加入7μL UNG，50℃，5min，不震荡；(4)、待离心管内样品温度降至室温后，在离心管中加入2μL的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置2分钟；(5)、向离心管中加入20ul蛋白酶K，65℃、450rpm孵育15分钟；(6)、在放有水相层的离心管中加入异丙醇200uL混合均匀，室温反应10min；(7)、向离心管中加入200μL裂解液2，涡旋震荡混匀后加入300μL异丙醇与20μL磁珠，涡旋震荡彻底混匀，于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合10分钟，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，弃去溶液；(8)、向离心管中加入750μL漂洗液1，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液，重复一次；(9)、向离心管中加入750μL漂洗液2，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液，重复一次；(10)、离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，之后开盖室温放置5～10分钟使乙醇充分挥发，向离心管中加入50～200μL洗脱液后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后将离心管固定于56℃、1600rpm的恒温混匀上震荡洗脱10分钟；(11)、随后将离心管在室温或加热10～15min，加热温度范围是30～80℃，使磁珠和细胞组织表面的有机溶剂残留量降低；(12)、将离心管固定于磁力架上静置2分钟，所得上清即为核酸产物，于
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20℃冰箱冻存即可。2.根据权利要求1所述的一种快速提取FFPE样本中DNA的提取方法，其特征在于：所述(1)中裂解液1为Buffer GTL，含10～100mM Tris
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HCL、1～5M的盐酸胍、0.05～0.5M NaCL和10～50mM EDTA、0.1～10％Triton
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X及水等，pH6.5～8.5，所述裂解液1含50mM Tris
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HCL、3M的盐酸胍、0.1M NaCL和10mM EDTA、0.5％Triton X
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100，pH为7.5。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏雨，殷剑峰，王春香，
申请(专利权)人：江苏康为世纪生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：