一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法及其应用技术

本申请涉及细胞分离培养的技术领域，具体公开了一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法及其应用，所述人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法包括：无菌分离脐带并冲洗，使用I型胶原酶溶液使血管充盈，孵育；剪开血管腔，剪成体积为1~2 mm3的组织块后，按3~5块/cm2的密度种植于培养瓶中；将种植有组织块的瓶底向上，加入完全培养液，静置后翻转培养瓶，使组织块没入完全培养液中，培养，并定期更换完全培养液；去除组织块，并进行连续传代培养。本申请通过对人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法进行优化，提高了细胞的活力，增殖速度更快，纯度高，存活率好，可连续传代20次以上，具有重要的研究价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法及其应用


[0001]本申请涉及细胞分离培养的
，更具体地说，涉及一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法及其应用。

技术介绍

[0002]心血管疾病已经成为危胁人类健康的首要疾病。血管疾病常为始发疾病，而且缺乏有效的治疗手段。血管平滑肌细胞的生长异常与血管病的形成、发展和疾病预后密切相关。血管平滑肌细胞是血管壁的重要构成成分，许多心血管疾病的发生都与其增殖、迁移、分化有着密切关系，例如血管炎症、斑块形成、动脉粥样硬化、再狭窄和肺动脉高压等。研究表明，动脉粥样硬化斑块(心脏病发作和中风的主要原因)中的大多数病源性细胞是由血管平滑肌细胞衍生的。
[0003]因此，以人血管平滑肌细胞为实验研究对象，探讨心血管疾病相关的发病机制是目前研究的热点；体外培养的血管平滑肌细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具有重要意义。
[0004]此外，越来越多的研究逐步开始用体外构建的类器官来替代实验动物，而血管作为皮肤的重要结构，在构建完整的皮肤类器官的过程中是必不可少的，已经有部分研究使用血管平滑肌细胞构建皮肤类器官。
[0005]人脐静脉平滑肌细胞分离自人体脐带组织，是脐静脉的重要结构组成细胞之一，在机体的正常生理过程中发挥着重要作用。脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构，形状如绳索，表面光滑透明，内含结缔组织、一支脐静脉和一对脐动脉。在子宫中，子宫动脉在胎盘的母体部分出的毛细血管与胎盘的子体部胎儿毛细血管靠近，在此处母体和胎儿的血液间进行CO2、O2、代谢废物和营养物质的交换。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘，脐静脉将O2和营养物质从胎盘运送给胎儿。脐带是分娩过程中的废弃物，这使得体外培养的脐静脉平滑肌细胞成为了研究血管的模型细胞。
[0006]然而，采用目前已有的脐静脉平滑肌细胞的分离方法，培养获得的细胞往往传代次数较少、扩增时间较长且活力较差，因此，如何提供一种传代次数多、扩增时间短、细胞活力好且纯度较高的人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法，已成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0007]为了提高分离培养的人脐静脉平滑肌细胞的活力及传代次数，本申请提供一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法及其应用，使用该方法分离培养得到的脐静脉平滑肌细胞活力好，纯度高，扩增时间短，可大规模连续传代培养20代以上，在相关的理论研究中具有重要的应用价值。
[0008]第一方面，本申请提供一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法，采用如下技术方案：
[0009]一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法，所述人脐静脉平滑肌细胞的分离培养
方法包括：
[0010]无菌分离脐带并冲洗，使用I型胶原酶溶液使血管充盈，孵育；
[0011]剪开血管腔，剪成体积为1～2mm3的组织块后，按3～5块/cm2的密度种植于培养瓶中；
[0012]将种植有组织块的瓶底向上，加入完全培养液，静置后翻转培养瓶，使组织块没入完全培养液中，培养，并定期更换完全培养液；
[0013]去除组织块，并进行连续传代培养。
[0014]本申请中，通过对人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法进行优化，显著提高了细胞的活性，增殖速度更快，缩短了细胞数量增加1倍所需的时间，在相同的培养时间内，细胞数量可达现有方法的1.5倍以上；获得的细胞可以连续传代20次以上并保证基因型的稳定，与现有的分离方法相比，传代次数显著提高的同时，细胞的生长状态也更好；分离培养后的细胞纯度高，可达98％以上，细胞存活率在99.5％以上，活性良好，可作为相关研究的模型细胞，具有重要的研究意义。
[0015]在一些具体的实施方案中，所述组织块的体积为1～1.5mm3或1.5～2mm3等。
[0016]在一个具体的实施方案中，所述组织块的体积为1mm3、1.5mm3或2mm3等。
[0017]在一些具体的实施方案中，所述种植的密度为3～4块/cm2或4～5块/cm2。
[0018]在一个具体的实施方案中，所述种植的密度为3块/cm2、4块/cm2或5块/cm2。
[0019]本申请中，将组织块的体积控制在1～2mm3的范围内，可以提高细胞的贴壁及爬出效率，增加获得的脐静脉平滑肌细胞的数量，提高原料的利用率。若组织块的体积较大，则不利于细胞的爬出，最终获得的细胞的数量较少，且造成了原材料的浪费；若组织块的体积较小，则组织块受外界环境的影响较大，不易贴壁，细胞容易层叠生长，不易获得单层细胞，且细胞的生理状态也较差，增殖能力较弱。
[0020]本申请中，将种植的密度控制在3～5块/cm2的范围内，有利于单层细胞的获得，并且可以提升细胞的活力，增加获得的细胞数量。若种植的密度较大，则组织块中爬出细胞的生长空间较小，容易产生多层细胞层叠的现象，并且也会影响细胞的继续爬出，导致最终获得的细胞数目较少；若种植的密度较小，则不利于爬出细胞之间的物质与信息交流，对细胞的活力也有一定的影响。另外，若组织块种植的密度过小，则不利于爬出的细胞形成均一的单细胞层，细胞容易聚集在组织块周围层叠生长，进而容易发生脱落及老化的现象；细胞达到传代培养所对应的融合度需要的时间也较长，不利于细胞活力的保持，同时也降低了细胞的增殖效率。
[0021]优选地，所述冲洗的方法包括使用36.5～37.5℃、含0.4％～0.6％肝素钠的D
‑
Hanks溶液进行清洗。
[0022]在一些具体的实施方案中，D
‑
Hanks溶液的温度为36.5～37℃或37～37.5℃等。
[0023]在一个具体的实施方案中，D
‑
Hanks溶液的温度为36.5℃、37℃或37.5℃等。
[0024]在一些具体的实施方案中，D
‑
Hanks溶液中肝素钠的浓度为0.4％～0.5％或0.5％～0.6％等。
[0025]在一个具体的实施方案中，D
‑
Hanks溶液中肝素钠的浓度为0.4％、0.5％或0.6％等。
[0026]本申请中，通过向D
‑
Hanks溶液中添加肝素钠，可以延缓血液的凝固，从而将脐带
中残留的血液冲洗得更加干净。
[0027]优选地，所述I型胶原酶溶液中I型胶原酶的浓度为0.5～2.5mg/mL。
[0028]在一些具体的实施方案中，所述I型胶原酶溶液中I型胶原酶的浓度为0.5～1mg/mL、0.5～1.5mg/mL、0.5～2mg/mL、1～1.5mg/mL、1～2mg/mL、1～2.5mg/mL、1.5～2mg/mL、1.5～2.5mg/mL或2～2.5mg/mL等。
[0029]在一个具体的实施方案中，所述I型胶原酶溶液中I型胶原酶的浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL或2.5mg/mL等。
[0030]优选地，所述孵育的方法包括：
[0031]使用D
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法包括：无菌分离脐带并冲洗，使用I型胶原酶溶液使血管充盈，孵育；剪开血管腔，剪成体积为1~2 mm3的组织块后，按3~5块/cm2的密度种植于培养瓶中；将种植有组织块的瓶底向上，加入完全培养液，静置后翻转培养瓶，使组织块没入完全培养液中，培养，并定期更换完全培养液；去除组织块，并进行连续传代培养。2.根据权利要求1所述的人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶溶液中I型胶原酶的浓度为0.5~2.5 mg/mL。3.根据权利要求1所述的人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述孵育的方法包括：使用D
‑
Hanks溶液浸没充盈后的血管，孵育28~35 min。4.根据权利要求1所述的人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述完全培养液包括胎牛血清、青链霉素混合液...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭瑞敏，曹毓琳，程世翔，李伟，
申请(专利权)人：天津经济技术开发区唐颐细胞智造与神经创伤修复研究院，
类型：发明
国别省市：