自身免疫疾病和免疫缺陷病症中的免疫组库生物标志物制造技术

本公开提供了用于基于表征受试者的B细胞免疫组库来预测患有自身免疫疾病或病症的所述受试者对治疗的临床应答的方法和/或用于基于表征所述受试者的所述B细胞免疫组库来预测患有免疫缺陷(例如，白血病)的所述受试者的预后的方法。在一方面，这些方法提供了在治疗之前确定样本中B细胞受体组库的类别转换重组和/或体细胞超突变的频率，并基于测得的类别转换和/或体细胞超突变频率预测受试者的预后和/或对治疗的应答。在另一方面，这些方法提供了确定免疫受体类别转换和/或体细胞超突变频率，并基于根据测得的类别转换和/或体细胞超突变频率所得到的预后和/或对治疗的应答的预测来治疗受试者。测来治疗受试者。测来治疗受试者。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】自身免疫疾病和免疫缺陷病症中的免疫组库生物标志物
[0001]相关申请
[0002]本申请案根据35 USC
§
119(e)要求2020年1月22日提交的美国临时申请第62/964,524号和2020年1月22日提交的美国临时申请第62/964,550号中的每一个的优先权和权益。前述申请案中的每一个的全部内容以全文引用的方式并入本文中。
[0003]序列表
[0004]本申请在此以引用的方式并入有与此同时提交的电子序列表材料。电子序列表中的材料以2021年1月21日创建的标题为“LT01523_ST25.txt”的文本(.txt)文档形式提交，其文件大小是185KB并且以全文引用的方式并入本文中。


[0005]本专利技术涉及用于制备靶免疫组库核酸序列的文库的方法以及其组合物和用途。

技术介绍

[0006]适应性免疫应答包含识别抗原的B细胞和T细胞的选择性应答。编码抗体(Ab，在B细胞中)和T细胞受体(TCR，在T细胞中)抗原受体的免疫球蛋白基因包含复合基因座，其中由于相应可变(V)、多样性(D)和连接(J)基因片段的重组，以及随后的在早期淋巴分化期间的体细胞超突变事件而产生广泛的受体多样性。每种受体的两个亚基链单独发生重组过程，并且随后，异二聚体配对产生仍更大的组合多样性。有助于人免疫受体组库的潜在组合可能性和连接可能性的计算已经估计，可能性的数量大大超过个体中外周B或T细胞的总数。参见，例如，Davis和Bjorkman(1988)《自然(Nature)》334：395
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402；Arstila等人.(1999)《科学(Science)》286：958
‑
961；van Dongen等人，《白血病(Leukemia)》，Henderson等人.(编辑)费城：WB桑德斯公司(Philadelphia：W.B.Saunders Company)，2002，第85
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129页。
[0007]多年来已经进行了广泛的努力以便以高分辨率改善对免疫组库的分析。用于特异性检测和监测淋巴细胞的扩增克隆的手段将为表征和分析正常免疫反应和应答和致病性免疫反应和应答提供重要机会。尽管付出了努力，但有效的高分辨率分析提供了挑战。如桑格(Sanger)测序等低通量技术可以提供分辨率，但仅限于提供广泛捕获整个免疫组库的有效手段。在下一代测序(NGS)方面取得的进展已经提供捕获组库的途径，然而，由于大量相关序列的性质和由所述技术引起的序列错误的引入，已经证明难以对真实组库进行高效和有效反映。正在开发能够解析高度可变的免疫细胞受体序列的复合群体的改善的测序方法和工作流程。仍需要有效分析大量免疫细胞受体组库的新方法，以更好地理解免疫细胞应答、增强诊断能力和处理能力并设计新的疗法。

技术实现思路

[0008]本文提供了用于基于表征受试者的B细胞免疫组库来预测患有自身免疫疾病或病症的受试者对治疗的临床应答的方法。本文附加地提供了用于基于表征受试者的B细胞免
疫组库来预测患有免疫缺陷的受试者的预后的方法。此类方法包含使用以下的至少一组执行单一多重扩增反应以扩增从受试者样本中获得的靶BCR核酸模板分子：
[0009]i)(a)针对包含V基因内的FR1的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物，
[0010](b)针对包含V基因内的FR2的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物，或
[0011](c)针对包含V基因内的FR3的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物；以及
[0012]ii)针对至少一个BCR编码序列的C基因的至少一部分的一个或多个C基因引物；
[0013]其中每组i)引物和ii)引物针对同一靶IgHBCR基因的编码序列，并且其中使用至少一组i)引物和ii)引物执行扩增产生代表样本中的靶BCR组库的扩增子分子；由此生成包含靶BCR组库的靶BCR扩增子分子。该方法还包含：对靶BCR扩增子分子执行测序并确定分子的序列，其中确定序列包括获得初始序列读段，将初始序列读段与参考序列进行比对，鉴别生产性读段以及校正一个或多个插入缺失错误以生成拯救的生产性序列读段；从所确定的靶BCR序列中鉴别BCR组库克隆群体；以及鉴别克隆中可变基因部分内的体细胞超突变(SHM)的频率。该方法还包括确定进行中的SHM频率，其中证明SHM的克隆谱系免疫受体克隆的VDJ区具有类似的核苷酸序列；和/或确定进行中的类别转换重组(CSR)频率。在一些实施例中，在样本中的B细胞免疫受体克隆的同一可变谱系中鉴别出至少一种转换同种型和/或转换同种型的组合。在一些实施例中，所提供的方法接下来包含将患有自身免疫疾病或病症的受试者鉴别为可能的(i)对化学治疗的应答者，这发生在当SHM频率小于样本中非转换IgM/IgD表达性B细胞中的频率阈值，并且免疫组库由样本中高频率的转换同种型IgG、IgA或IgE表达性B细胞主导时，(ii)对化学治疗的无应答者，这发生在当SHM频率大于频率阈值，并且免疫组库由样本中高频率的非转换IgM/IgD表达性B细胞主导时，和/或(iii)对免疫治疗的应答者，这发生在当SHM频率大于频率阈值，并且免疫组库由样本中高频率的非转换IgM/IgD表达性B细胞主导时。在一些实施例中，所提供的方法接下来包含根据以下亚类对组库克隆进行分类：I类：无进行中的CSR或SHM，无V基因SHM；II类：无进行中的CSR或SHM，V基因SHM大于零，小于6％；III类：无进行中的CSR或SHM，V基因SHM大于约6％；IV类：进行中的CSR和/或SHM；以及基于B细胞免疫组库的亚分类鉴别患有免疫缺陷的受试者的预后：I类：最差预后；II类：不良预后；III类：良好预后和IV类：最好预后。
[0014]附加地提供了基于表征受试者的B细胞免疫组库来将具有自身免疫疾病或病症的症状的受试者诊断为患有慢性可变免疫缺陷病症的方法。在一些实施例中，此类方法包含使用以下的至少一组执行单一多重扩增反应以扩增从受试者样本中获得的靶BCR核酸模板分子：
[0015]i)(a)针对包含V基因内的FR1的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物，
[0016](b)针对包含V基因内的FR2的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物，或
[0017](c)针对包含V基因内的FR3的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物；以及
[0018]ii)针对至少一个BCR编码序列的C基因的至少一部分的一个或多个C基因引物；
[0019]其中每组i)引物和ii)引物针对同一靶IgH BCR基因的编码序列，并且其中使用至少一组i)引物和ii)引物执行扩增产生代表样本中的靶BCR组库的扩增子分子；由此生成包含靶BCR组库的靶BCR扩增子分子。该方法还包含：对靶BCR扩增子分子执行测序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于基于表征受试者的B细胞免疫组库来预测患有自身免疫疾病或病症的所述受试者对治疗的临床应答的方法，其包含：a)执行多重扩增反应以扩增源自受试者的生物样本的靶B细胞免疫受体核酸模板分子，其中所述多重扩增反应包含以下的至少一组：i)(a)针对包含V基因内的框架区1(FR1)的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物，(b)针对包含V基因内的框架区2(FR2)的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物，或(c)针对包含V基因内的框架区3(FR3)的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物；以及ii)针对所述至少一个BCR编码序列的C基因的至少一部分的一个或多个C基因引物；其中每组i)和ii)引物针对靶IgH BCR基因的编码序列，并且其中执行所述扩增产生代表所述样本中的靶BCR组库的扩增子分子，从而生成包含靶免疫受体组库的靶B细胞免疫受体扩增子分子；b)对靶免疫受体组库扩增子执行测序；c)从所述测序中鉴别免疫受体克隆以及鉴别所述免疫受体克隆中可变基因部分内的体细胞超突变(SHM)的水平，其中证明SHM的克隆谱系免疫受体克隆的VDJ区具有类似的核苷酸序列；d)确定所述样本中B细胞免疫受体克隆的亚类以及所述样本中非转换IgM和/或IgD和转换IgG、IgA和/或IgE表达性细胞的频率；以及e)将所述受试者鉴别为可能的(i)对化学治疗的应答者，这发生在当SHM频率小于所述样本中非转换IgM/IgD表达性B细胞中的频率阈值，并且所述免疫组库由所述样本中高频率的转换同种型IgG、IgA或IgE表达性B细胞主导时，(ii)对化学治疗的无应答者，这发生在当所述SHM频率大于频率阈值，并且所述免疫组库由所述样本中高频率的非转换IgM/IgD表达性B细胞主导时，和/或(iii)对免疫治疗的应答者，这发生在当所述SHM频率大于频率阈值，并且所述免疫组库由所述样本中高频率的非转换IgM/IgD表达性B细胞主导时。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个V基因引物中的每一个，和/或多个C基因引物中的一个具有以下标准中的任何一个或多个：(1)在所述引物内包括两个或更多个经修饰的核苷酸，所述核苷酸中的至少一个核苷酸包括在所述引物的末端附近或末端处，并且所述核苷酸中的至少一个核苷酸包括在所述引物的中心核苷酸位置处或中心核苷酸位置周围；(2)长度为约15到约40个碱基长；(3)T
m
为高于60℃到约70℃；(4)与在所述样本中存在的非靶序列的交叉反应性低；(5)至少前四个核苷酸(从3
′
到5
′
方向)与在同一反应中存在的任何其它引物内的任何序列不互补；以及(6)与在任何其它所产生的靶扩增子内的至少5个核苷酸的任何连续段不互补。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述多个V基因引物和/或所述一个或
多个C基因引物中的每一个包括一个或多个可切割基团，所述一个或多个可切割基团优选地位于(i)所述引物的所述末端附近或所述末端处，或(ii)所述引物的所述中心核苷酸附近或所述中心核苷酸周围。4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述多个V基因引物和/或所述一个或多个C基因引物中的每一个包括选自以下的具有可切割基团的两个或更多个经修饰的核苷酸：甲基鸟嘌呤、8
‑
氧代
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鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、5，6
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二氢尿嘧啶、尿嘧啶、5
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甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶二聚体、7
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甲基鸟苷、8
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氧代
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脱氧鸟苷、黄嘌呤核苷、肌苷、二氢尿苷、溴脱氧尿苷、尿苷或5
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甲基胞苷。5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述多个V基因引物与所述模板分子的FR1部分的至少一部分退火，并且其中所述一个或多个C基因引物包含与所述模板分子的C基因部分的至少一部分退火的至少五个引物。6.根据权利要求5所述的方法，其中所生成的靶BCR扩增子分子包括靶BCR基因序列的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。7.根据权利要求5所述的方法，其中至少一组i)和ii)分别选自表3和表6
‑
10的引物。8.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一组i)和ii)选自表11的引物组。9.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述至少一组i)和ii)为i)(c)和ii)(a)，其中所述多个V基因引物与所述模板分子的FR3部分的至少一部分退火，并且其中所述一个或多个C基因引物包含与所述模板分子的所述C基因部分的至少一部分退火的至少五个引物。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述所生成的靶BCR扩增子分子包括所述靶BCR基因序列的互补决定区CDR3。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一组i)和ii)分别选自表2和表6
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10的引物。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述SHM频率截止为8％。13.根据权利要求1所述的方法，其还包含在步骤b)之前将至少一个衔接子添加至靶免疫受体扩增子分子中的至少一个中，从而产生衔接子修饰的靶免疫受体扩增子分子文库。14.根据权利要求13所述的方法，其中通过连接添加所述至少一个衔接子。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述测序包括获得初始序列读段，将所述初始序列读段与参考序列进行比对，鉴别生产性读段以及校正一个或多个插入缺失错误以生成拯救的生产性序列读段。16.根据权利要求15所述的方法，其中生产性读段和拯救的生产性读段的组合是测序读段的至少50％。17.一种基于表征受试者的B细胞免疫组库来将具有自身免疫疾病或病症的症状的所述受试者诊断为患有慢性可变免疫缺陷病症的方法，其包含：a)执行多重扩增反应以扩增源自受试者的生物样本的靶B细胞免疫受体核酸模板分子，其中所述多重扩增反应包含以下的至少一组：i)(a)针对包含V基因内的框架区1(FR1)的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物，
(b)针对包含V基因内的框架区2(FR2)的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物，或(c)针对包含V基因内的框架区3(FR3)的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物；以及ii)针对所述至少一个BCR编码序列的C基因的至少一部分的一个或多个C基因引物；其中每组i)和ii)引物针对靶IgH BCR基因的编码序列，并且其中执行所述扩增产生代表所述样本中的靶BCR组库的扩增子分子，从而生成包含靶免疫受体组库的靶B细胞免疫受体扩增子分子；b)对靶免疫受体组库扩增子执行测序；c)从所述测序中鉴别免疫受体克隆以及鉴别所述免疫受体克隆中可变基因部分内的体细胞超突变(SHM)的水平，其中证明SHM的克隆谱系免疫受体克隆的VDJ区具有类似的核苷酸序列；d)确定所述样本中B细胞免疫受体克隆的类别转换重组频率；以及e)当SHM频率小于转换同种型中的频率阈值、所述样本中类别转换重组(CSR)的频率小于频率阈值，并且所述免疫组库由所述样本中的非转换IgM/IgD表达性B细胞主导时，将所述受试者鉴别为患有原发性免疫缺陷病症，从而诊断所述受试者患有慢性可变免疫缺陷病症。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多个V基因引物中的每一个，和/或多个C基因引物中的一个具有以下标准中的任何一个或多个：(1)在所述引物内包括两个或更多个经修饰的核苷酸，所述核苷酸中的至少一个核苷酸包括在所述引物的末端附近或末端处，并且所述核苷酸中的至少一个核苷酸包括在所述引物的中心核苷酸位置处或中心核苷酸位置周围；(2)长度为约15到约40个碱基长；(3)T
m
为高于60℃到约70℃；(4)与在所述样本中存在的非靶序列的交叉反应性低；(5)至少前四个核苷酸(从3
′
到5
′
方向)与在同一反应中存在的任何其它引物内的任何序列不互补；以及(6)与在任何其它所产生的靶扩增子内的至少5个核苷酸的任何连续段不互补。19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中所述多个V基因引物和/或所述一个或多个C基因引物中的每一个包括一个或多个可切割基团，所述一个或多个可切割基团优选地位于(i)所述引物的所述末端附近或所述末端处，或(ii)所述引物的所述中心核苷酸附近或所述中心核苷酸周围。20.根据权利要求17到19中任一项所述的方法，其中所述多个V基因引物和/或所述一个或多个C基因引物中的每一个包括选自以下的具有可切割基团的两个或更多个经修饰的核苷酸：甲基鸟嘌呤、8
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氧代
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鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、5，6
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二氢尿嘧啶、尿嘧啶、5
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甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶二聚体、7
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甲基鸟苷、8
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氧代
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脱氧鸟苷、黄嘌呤核苷、肌苷、二氢尿苷、溴脱氧尿苷、尿苷或5
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甲基胞苷。21.根据权利要求17到21中任一项所述的方法，其中所述多个V基因引物与所述模板分子的FR1部分的至少一部分退火，并且其中所述一个或多个C基因引物包含与所述模板分子
的C基因部分的至少一部分退火的至少五个引物。22.根据权利要求21所述的方法，其中所生成的靶BCR扩增子分子包括靶BCR基因序列的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。23.根据权利要求21所述的方法，其中至少一组i)和ii)分别选自表3和表6
‑
10的引物。24.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一组i)和ii)选自表11的引物组。25.根据权利要求17到20中任一项所述的方法，其中所述至少一组i)和ii)为i)(c)和ii)(a)，其中所述多个V基因引物与所述模板分子的FR3部分的至少一部分退火，并且其中所述一个或多个C基因引物包含与所述模板分子的所述C基因部分的至少一部分退火的至少五个引物。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述所生成的靶BCR扩增子分子包括所述靶BCR基因序列的互补决定区CDR3。27.根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一组i)和ii)分别选自表2和表6
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10的引物。28.根据权利要求17所述的方法，其还包含在步骤b)之前将至少一个衔接子添加至靶免疫受体扩增子分子中的至少一个中，从而产生衔接子修饰的靶免疫受体扩增子分子文库。29.根据权利要求28所述的方法，其中通过连接添加所述至少一个衔接子。30.根据权利要求17所述的方法，其中所述测序包括获得初始序列读段，将所述初始序列读段与参考序列进行比对，鉴别生产性读段以及校正一个或多个插入缺失错误以生成拯救的生产性序列读段。31.根据权利要求30所述的方法，其中生产性读段和拯救的生产性读段的组合是测序读段的至少50％。32.一种用于基于受试者的B细胞免疫组库来治疗患有自身免疫疾病或病症的所述受试者的方法，其包含：a)执行多重扩增反应以扩增源自受试者的生物样本的靶B细胞免疫受体核酸模板分子，其中所述多重扩增反应包含以下的至少一组：i)(a)针对包含V基因内的框架区1(FR1)的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物，(b)针对包含V基因内的框架区2(FR2)的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物，或(c)针对包含V基因内的框架区3(FR3)的至少一部分的至少一个BCR编码序列的大多数不同V基因的多个V基因引物；以及ii)针对所述至少一个BCR编码序列的C基因的至少一部分的一个或多个C基因引物；其中每组i)和ii)引物针对靶IgH BCR基因的编码序列，并且其中执行所述扩增产生代表所述样本中的靶BCR组库的扩增子分子，从而生成包含靶免疫受体组库的靶B细胞免疫受体扩增子分子；b)对靶免疫受体组库扩增子执行测序；c)从所述测序中鉴别免疫受体克隆以及鉴别所述免疫受体克隆中可变基因部分内的
体细胞超突变(SHM)的水平，其中证明SHM的克隆谱系免疫受体克隆的VDJ区具有类似的核苷酸序列；d)确定所述样本中B细胞免疫受体克隆的类别转换重组频率；以及e)用以下方法治疗所述受试者：(i)化学治疗，这发生在当SHM频率小于所述样本中非转换IgM/IgD表达性B细胞中的频率阈值，并且所述免疫组库由所述样本中高频率的转换同种型IgG、IgA或IgE表达性B细胞主导时，(ii)免疫治疗，这发生在当所述SHM频率大于频率阈值，并且所述免疫组库由所述样本中高频率的非转换IgM/IgD表达性B细胞主导时。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述多个V基因引物中的每一个，和/或多个C基因引物中的一个具有以下标准中的任何一个或多个：(1)在所述引物内包括两个或更多个经修饰的核苷酸，所述核苷酸中的至少一个核苷酸包括在所述引物的末端附近或末端处，并且所述核苷酸中的至少一个核苷酸包括在所述引物的中心核苷酸位置处或中心核苷酸位置周围；(2)长度为约15到约40个碱基长；(3)T
m
为高于60℃到约70℃；(4)与在所述样本中存在的非靶序列的交叉反应性低；(5)至少前四个核苷酸(从3
′
到5
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方向)与在同一反应中存在的任何其它引物内的任何序列不互补；以及(6)与在任何其它所产生的靶扩增子内的至少5个核苷酸的任何连续段不互补。34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述多个V基因引物和/或所述一个或多个C基因引物中的每一个包括一个或多个可切割基团，所述一个或多个可切割基团优选地位于(i)所述引物的所述末端附近或所述末端处，或(ii)所述引物的所述中心核苷酸附近或所述中心核苷酸周围。35.根据权利要求32到34中任一项所述的方法，其中所述多个V基因引物和/或所述一个或多个C基因引物中的每一个包括选自以下的具有可切割基团的两个或更多个经修饰的核苷酸：甲基鸟嘌呤、8
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氧代
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鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、5，6
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【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：生命科技公司，
类型：发明
国别省市：