孢囊线虫属病原体抗性基因制造技术

通过提供本发明专利技术的介导孢囊线虫属抗性的核酸分子，可以更有效地抗甜菜胞囊线虫侵染育种或开发新的抗性品系；具体而言，靶植物中的显性抗性作用是由所鉴定的核酸分子的性质引起的。介导孢囊线虫属抗性的核酸分子，以及前面描述的本发明专利技术的实施方案，提供了例如抗性基因等位基因在顺式遗传或反式遗传方法中的应用，目的是开发新的抗性栽培种。目的是开发新的抗性栽培种。目的是开发新的抗性栽培种。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】孢囊线虫属病原体抗性基因
专利

[0001]本专利技术涉及一种核酸分子，当其存在于植物中时能赋予对孢囊线虫属 (Heterodera)病原体的抗性，特别是对甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)的抗性，特别是在甜菜(Beta vulgaris)植物中，以及本专利技术涉及由根据本专利技术的核酸分子编码的多肽。特别地，根据本专利技术的核酸分子的特征在于由于存在所述核酸分子而赋予的对孢囊线虫属病原体的抗性作用是显性的。此外，本专利技术涉及孢囊线虫属抗性的植物、植物细胞、植物器官、植物组织、植物部分或植物的种子或后代，其包含作为内源基因、作为编辑的基因或者作为转基因的所述核酸分子或其一部分。此外，本专利技术还涵盖在植物、特别是在糖用甜菜(Beta vulgaris)植物中增加对孢囊线虫属病原体的抗性的方法，以及产生或鉴定和可能的选择孢囊线虫属抗性植物的方法。本专利技术还涵盖监测病原体甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)侵染的方法，以及用于与根据本专利技术的核酸分子杂交的寡核苷酸探针和引物。
[0002]专利技术背景
[0003]据报道，在商业种植的甜菜中，超过两打不同的线虫种类会造成经济损失(Hafez，Sugar Beet nematodes in Idaho and Eastern Oregon(1997)， University of Idaho，College of Agriculture)。甜菜最严重的线虫害虫是甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)(Cooke，Agricultural Zoology Reviews 2(1987)， 132
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183)，其在德国和欧洲的大多数甜菜种植区具有最高的经济重要性。甜菜胞囊线虫于1859年在德国首次被发现，据估计目前全世界10
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25％的甜菜产区可能会受到这种害虫的侵扰，导致产量损失高达80％(Hafez 1997)，其中产量损失取决于土壤中线虫的数量、甜菜的播种和侵染时间以及天气条件。
[0004]甜菜胞囊线虫是一种植物病原性线虫，不仅在糖用甜菜中而且在其它甜菜如红甜菜、饲料甜菜和叶甜菜(chard)以及其它植物科中通过严重损害根部系统而造成相当大的产量损失，尤其是在夏季，所述其它植物例如苋科植物如菠菜，十字花科植物如油菜籽、卷心菜、大白菜、花椰菜、球芽甘蓝、西兰花、芜菁、萝卜和芜菁甘蓝。这种线虫还侵染许多常见的杂草，如衍生芜菁、荠菜、白花藜和马齿苋。
[0005]在糖用甜菜田地中，甜菜胞囊线虫侵染最初表现为生长阻碍的植株的圆形至椭圆形区域。线虫以植物根部为食，降低植物吸收养分和水分的能力。因此，地上症状表现为营养缺乏或干旱、直立减少、生长不良、生长阻碍、变黄和萎蔫，其中所述症状根据感染时的生长阶段而有所不同。当幼苗被感染时，症状包括生长阻碍和叶片生长减少，并且在一天中的炎热时期较老的外部叶片会变黄并枯萎。受侵染的作物含有价值和质量降低的较小植物，并且与杂草的竞争很差。
[0006]这种疾病的传播是持续的，害虫对种植者来说变得越来越难以管理。然而，控制害虫至关重要，因为高土壤线虫种群会使糖用甜菜生产的经济价值降低。存在不同的抗击疾病的方法，但目前应用的实践中没有一种是令人满意的。通过杀线虫剂对甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)进行化学控制不仅会给农民带来成本并污染环境，而且在许多国
家也不再允许，而土壤净化不适用于较大的田地。此外，为了减少线虫的数量，仅每四年或更低频率种植糖用甜菜的作物轮作并不总是可行且不够有效。另一种常见的管理实践包括种植线虫抗性的填闲作物，如油萝卜或芥菜。这些植物会吸引害虫，但会抑制其发育和繁殖，从而减少害虫数量。也可以种植抗性或耐受性糖用甜菜品种。迄今为止，减少土壤线虫数量的最有效方法是种植抗性糖用甜菜品种。
[0007]同时，在标记库(marked harboring)上提供了线虫抗性和耐受性糖用甜菜品种，例如来自平匐甜菜(Beta procumbens)的针对甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii)的主要抗性基因(Heijbroek et al.，Euphytica 38(1988)，121
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131； Lange et al.，Proceedings of the 53rd IIRB Congress，Brussels(1990)，89
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102)。在易位的平匐甜菜(Beta procumbens)节段中，即整合在甜菜(B.vulgaris)染色体9末端的平匐甜菜(B.procumbens)染色体1节段中，通过定位克隆将 Hs1pro
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1基因鉴定为因果因子Cai et al.，Science 275(1997)，832
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834)。然而，当将平匐甜菜(Beta procumbens)染色体1节段整合到甜菜(Beta vulgaris)的基因组中时，不仅将所需甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)抗性引入植物中，而且通常还引入了不需要的特征，例如由于与孢囊线虫属抗性的积极特征相连锁的其它基因的遗传所致产量降低。这种现象也被称为“连锁累赘”。因此，由于连锁累赘以及另外由于易位的不稳定性，这个基因在育种中的使用具有显著产量罚分的限制。
[0008]在法国收集的材料中在野生海甜菜甜菜亚种沿海甜菜(B.vulgaris subsp. maritima)中发现了线虫抗性的另一个来源(Hijner，Meded.Inst.rat. Suikerprod.21(1951)，1
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13)。然而，到目前为止还完全不清楚孢囊线虫属抗性的遗传和功能背景以及抗性基因的鉴定。
[0009]然而，如上所述，具有所述抗性的栽培种的缺点在于由于复杂的遗传过程导致栽培种的开发非常费力和复杂，并且这些栽培种在不存在侵染的情况下相对于正常栽培种具有明显较差的产量性能。除其它外，这可能与一些抗性基因与负责糖生产的基因的表观遗传相互作用有关，这会导致在没有病原体的情况下降低植物的适应性。
[0010]在实践中不可能使用基于例如通过TALE核酸酶或CRISPR系统的基因编辑的新育种技术以及转基因方法，因为尚未鉴定和表征参与抗性发生的基因。
[0011]为了对抗甜菜胞囊线虫的可持续育种，即抵抗克服抗性的孢囊线虫属变种的危险，有必要不断鉴定新的抗性基因并将其整合到栽培植物如糖用甜菜的基因库中。具体而言，目的在于提供合适的抗性基因，当这些基因存在于植物中时，其本身就已经产生了非常大的、显性的甜菜胞囊线虫 (Heterodera schachtii)抗性作用。根据本专利技术，这个目的通过权利要求和说明书中表征的实施方案来实现。
[0012]专利技术详述
[0013]本专利技术涉及一种核酸分子，所述该核酸分子在植物中、特别是在甜菜 (Beta vulgaris)亚种vulgaris中赋予对孢囊线虫属病原体、尤其是甜菜胞囊线虫(Heterodera scha本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核苷酸序列，其用于增加其中表达所述核酸分子的植物针对孢囊线虫属(Heterodera)线虫的抗性，其特征在于所述核苷酸序列选自由以下组成的组：(a)核苷酸序列，其包含选自SEQ ID NO:1、4和7的序列或其功能片段；(b)核苷酸序列，其包含选自SEQ ID NO:2、5和8的编码序列或其功能片段；(c)核苷酸序列，其在严格条件下与根据(a)、(b)、(f)或(g)的核苷酸序列的互补序列杂交；(d)核苷酸序列，其包含与(a)、(b)、(f)或(g)任一项的核苷酸序列的序列具有至少70％相同性的序列；(e)核苷酸序列，其包含通过缺失、取代、插入、转换和/或添加一个或多个核苷酸而是(a)、(b)、(f)或(g)的等位基因或衍生物的DNA序列；(f)核苷酸序列，其编码具有选自SEQ ID NO:3、6和9的氨基酸序列的多肽，或其功能片段；(g)核苷酸序列，其编码具有与选自SEQ ID NO:3、6和9的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽；(h)核苷酸序列，其由于遗传密码的简并性是(a)至(g)任一项的DNA序列的变体；其中所述核苷酸序列任选与启动子可操作地连接。2.一种载体或表达盒，其包含根据权利要求1的核苷酸序列。3.一种细胞，其包含根据权利要求1的核酸分子或根据权利要求2的载体或表达盒。4.一种丸粒化种子和/或催芽种子，其包含根据权利要求1的核苷酸序列、根据权利要求2的载体或表达盒或根据权利要求3的细胞。5.根据权利要求4的丸粒化种子和/或催芽种子，其特征在于所述丸粒化种子和/或催芽种子包含根据权利要求1的核苷酸序列或内源地或转基因地包含编码相同多肽的序列。6.根据权利要求4的丸粒化种子和/或催芽种子，其中含有内源性核苷酸序列的丸粒化种子和/或催芽种子属于甜菜(Beta vulgaris)物种且不是甜菜亚种沿海甜菜(B.vulgaris subsp.maritima)。7.根据权利要求4、5或6的丸粒化种子和/或催芽种子，其已经经历了选自下组的处理：(a)抛光(b)结壳(c)着色。8.一种提高植物对孢囊线虫属(Heterodera)线虫的抗性的方法，包括以下步骤：(i)将根据权利要求1的核苷酸序列通过同源定向修复或同源重组，优选通过定点核酸酶促进的同源定向修复或同源重组整合到植物的至少一个细胞的基因组中，以及任选从所述植物细胞再生植物；或者(ii)增加根据权利要求1的核苷酸序列编码的多肽在植物中的表达，优选通过修饰天然启动子或通过将多肽编码序列与比天然启动子表现出更高活性的异源启动子，特别是在侵染孢囊线虫属病原体之后比天然启动子表现出更高活性的异源启动子融合，来增加根据权利要求1的核苷酸序列编码的多肽在植物中的表达；或者(iv)用根据权利要求1的核苷酸序列或包含根据权利要求1的核苷酸序列的载体或表达盒转化植物细胞，以及任选从转化的植物细胞再生转基因植物。
9.一种产生对孢囊线虫属(Heterodera)线虫具有抗性的植物的方法，包括以下步骤：(a)用根据权利要求1的核苷酸序列或包含根据权利要求1的核苷酸序列的载体或表达盒转化植物细胞；和(b)从转化的植物细胞再生转基因植物；或者(i)将定点核酸酶和修复基质引入植物细胞中，其中所述定点核酸酶能产生细胞基因组中DNA的至少一个单链断裂或至少一个双链断裂，优选在靶区域的上游和/或下游产生细胞基因组中DNA的至少一个单链断裂或至少一个双链断裂，且所述修复基质包含根据权利要求1的核苷酸序列或根据权利要求1的核苷酸序列的多肽编码部分；(ii)在允许同源定向修复或同源重组的条件下培养来自(i)的细胞，其中将所述核苷酸序列从修复基质整合到植物基因组中；和(iii)从(ii)中修饰的细胞再生植物；或者(I)将定点核酸酶或碱基编辑器引入植物细胞中，优选甜菜(Beta)属植物中，更优选甜菜(Beta vulgaris)物种植物中，其中所述定点核酸酶产生细胞基因组中DNA的至少一个单链断裂或至少一个双链断裂，优选在与根据权利要求1的核苷酸序列同源的靶区域的上游、下游或之内产生细胞基因组中DNA的至少一个单链断裂或至少一个双链断裂，(II)在允许修饰靶区域的条件下培养来自(I)的细胞，所述修饰选自：(1)置换至少一个核苷酸；(2)缺失至少一个核苷酸；(3)插入至少一个核苷酸；或者(4)上述(1)至(3)的任意组合；和(III)从(II)中修饰的细胞再生植物。10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述靶区域a)位于根据SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的标记s5e3001s02与根据SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的标记s5e4668xxx之间，或b)侧翼为根据SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的标记s5e3001s02和根据SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的标记s5e4668xxx，或c)包含在根据SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的标记s5e3001s02与根据SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的标记s5e4668xxx之...

【专利技术属性】
技术研发人员：O，
申请(专利权)人：科沃施种子欧洲股份两合公司，
类型：发明
国别省市：