一种可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻快速检测方法技术

本发明专利技术属于海洋环境保护领域，一种我国近海可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻Phaeocystis globosa的快速检测方法。本发明专利技术所提供的定量检测方法可以对我国近海可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻进行检测和监控，具有特异性高、灵敏度高、检测快速、检测范围广等优点。等优点。等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻快速检测方法


[0001]本专利技术属于海洋环境保护领域，一种我国近海可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻Phaeocystis globosa的快速检测方法。

技术介绍

[0002]球形棕囊藻Phaeocystis globosa是一种全球广布的微藻，在热带和温带近海海域常发生有害赤潮，其生活史较为复杂，分为游离单细胞和胶质囊体两个阶段，当海水中出现大量的囊体意味着球形棕囊藻赤潮的暴发。球形棕囊藻赤潮暴发时产生的有毒物质常造成海洋生物的死亡；产生的囊体表面的胶状物质阻塞海洋鱼类的呼吸器官导致其窒息死亡；赤潮消亡时，高生物量的球形棕囊藻细胞分解消耗大量氧气，造成水体缺氧，严重海洋生物的生存。自从1997年在我国东南沿海首次暴发后，球形棕囊藻赤潮已成为我国东南沿海最为严重的赤潮灾害。我国东南沿海的球形棕囊藻赤潮具有一个独特的特征，即赤潮过程中球形棕囊藻可以形成厘米级大小的囊体。形成的厘米级大小的囊体常堵塞沿岸的核电冷源系统，对核电安全产生造成不利影响。
[0003]海水中囊体出现前，球形棕囊藻以游离单细胞方式存在。球形棕囊藻游离单细胞直径约为3
‑
9μm，在形态上难以与其它藻类区分，因此常规显微观察和计数方法不适用于球形棕囊藻游离细胞的定量检测。其它检测手段，包括色素分析、流式细胞计数、荧光原位杂交等，由于特异性低，检出限高，灵敏度差等缺点，也不适用于球形棕囊藻游离单细胞定量检测，限制对赤潮早期的监测预警。
[0004]球形棕囊藻具有复杂的遗传多样性和多样化的形态学特征，通过多年研究，发现我国东南沿海分布的球形棕囊藻中，部分藻株可形成厘米级大小的囊体，而其它的藻株形成的囊体小于3毫米(王锦秀等，2019,六株球形棕囊藻的色素组成特征研究,海洋与湖沼,50(3):611
‑
620；胡晓坤等，2019,北部湾海域球形棕囊藻遗传多样性分析,海洋与湖沼,50(3):601
‑
610)。其中仅可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻是我国近海球形棕囊藻赤潮的致灾种。因此，急需一种特异检测可形成厘米级囊体的球形棕囊藻，且检出限低的定量检测技术，为我国东南沿海球形棕囊藻赤潮的发生和发展过程的监测、以及为预防球形棕囊藻赤潮暴发所带来的危害提供技术支持。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供一种检测速度快、灵敏性高、特异性检测可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻的定量方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：
[0007]一种用于检测可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻的特异性引物和探针，所述特异性的引物和探针为：
[0008]上游引物:PG
‑
F 5
′‑
GTCGTAGGTTAAGGCTTCAA
‑3′
[0009]下游引物:PG
‑
R 5
′‑
AGTCGCTAACAGTAGAAAGAATAG
‑3′
[0010]探针:PG
‑
Pr 5
′‑
TGCGGCCCAAACATTTTCAGCT
‑3′
。
[0011]所述探针的5
′
端连接Texas Red荧光染料。
[0012]一种特异性引物和探针的应用，所述特异性引物和探针在检测可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻中的应用。
[0013]一种检测可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻的试剂盒，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的特异性引物和探针。
[0014]一种检测球形棕囊藻的方法，以样品中藻基因组总DNA为模板，利用可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻的特异性引物和探针通过荧光定量PCR扩增和荧光信号对样品中的可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻进行检测。
[0015]所述荧光定量PCR体系为：反应总体积为10μL，包括基因组DNA 1μL，2
×
Probe qPCR Mix Buffer(Takara，Takara商业化产品，无中文)5μL，上游引物、下游引物、探针各0.2μL(浓度10μM)，灭菌去离子水3.4μL。
[0016]所述荧光定量PCR条件为95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，40个循环，收集Texas Red荧光。
[0017]本专利技术所具有的优点：
[0018]本专利技术的检测方法以线粒体atp8为目标基因，该基因在细胞内的拷贝数稳定，且具有分辨可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻和其它球形棕囊藻的能力。本专利技术的检测方法针对可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻的线粒体atp8的序列设计特异性引物和Taqman探针，采用荧光定量PCR技术手段进行检测。
[0019]本专利技术具有以下的优点：
[0020]1.特异性高，本专利技术的qPCR方法可对球形棕囊藻种下水平建立的定量检测方法，特异性定量检测我国近海可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻；
[0021]2.灵敏度高，本专利技术的qPCR方法最低检测限达到1个细胞水平，可对海域中低丰度的可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻进行检测，进而有助于棕囊藻赤潮早期的预测预警；
[0022]3.检测范围广，本专利技术的的qPCR方法检出限范围在30cells/L
‑3×
108cells/L，检测范围广，达到7个数量级，满足野外调查的需求；
[0023]4.检测速度快，本专利技术的qPCR方法易操作，节省时间，可在短时间内得到结果。
附图说明
[0024]图1为本专利技术实例提供qPCR反应退火/延伸温度图。
[0025]图2为本专利技术实例提供的工作曲线。
[0026]图3为本专利技术实施例提供的种间特异性验证图。
[0027]图4为本专利技术实施例提供的种内特异性验证图。
[0028]图5为本专利技术实施例提供的检出限图。
具体实施方式
[0029]以下结合实例对本专利技术的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本专利技术，并不局限于本专利技术。
[0030]实施例1
[0031]检测可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻方法的建立：
[0032]1.1引物、探针的设计
[0033]从Genbank中获取6株定鞭藻(Chrysochromulina parva NC036938、Chrysochromulina sp.KJ201908、Pavlova lutheri HQ908424,Pavlova sp.MN564259、Phaeocystis antarctica JN131834和Phaeocystis globosa KC967226)线粒体atp8的序列信息，进行序列比对。根据比对结果，利用Primer 5.05软件设计线粒体atp8序列的扩增引物(上游引物：PG
‑
atp8
‑
F5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测我国近海可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性的引物和探针为：上游引物:PG
‑
F 5
′‑
GTCGTAGGTTAAGGCTTCAA
‑3′
下游引物:PG
‑
R 5
′‑
AGTCGCTAACAGTAGAAAGAATAG
‑3′
探针:PG
‑
Pr 5
′‑
TGCGGCCCAAACATTTTCAGCT
‑3′
。2.按权利要求1所述用于检测可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针的5
′
端连接Texas Red荧光染料。3.一种权利要求1所述特异性引物和探针的应用，其特征在于：所述特异性引物和探针在检测可形成厘米级大小囊体的球形棕囊藻中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：张清春，于仁成，牛壮，刘超，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：