具有宽检测线性范围的苹果酸传感电极及制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及具有宽检测线性范围的苹果酸传感电极及制备方法和应用，该电极包括基底电极和利用固定化载体共固定于电极表面的NADH氧化酶和苹果酸脱氢酶。本发明专利技术的苹果酸生物传感器具有较宽的线性检测范围为2~8 mM，响应时间平均值为25 s，并具有较好的抗干扰性，可直接应用于的高浓度苹果酸的检测，为后续开发苹果酸在线检测设备奠定了理论与应用基础。果酸在线检测设备奠定了理论与应用基础。果酸在线检测设备奠定了理论与应用基础。

【技术实现步骤摘要】
具有宽检测线性范围的苹果酸传感电极及制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物传感器的
，具体涉及具有宽检测线性范围的苹果酸传感电极及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]苹果酸，又称羟基琥珀酸，是一种C4
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二羧酸。广泛应用于食品、化妆品、制药、水处理、织物染色、生物可降解聚合物等领域。现有技术中，苹果酸的人工制备主要通过微生物发酵法、传统酶固定化法和集成技术(反应与分离耦合技术)等方法实现。苹果酸作为一种平台有机酸化合物，应用范围较广，具有重大经济价值。
[0003]当前的苹果酸发酵过程的浓度检测主要使用色谱法或电泳法来完成。然而，这些方法存在不太敏感、不能确定确切浓度、耗时长、需要进行样品预处理等问题。目前大多数报道的苹果酸生物传感器是单酶安培生物传感器，使用的是固定在反应器中的NADP
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依赖的苹果酸酶。这些方法存在检测时间较长、检测范围较窄、检测效率低及抗干扰能力较弱等问题，因此亟需开发一种具有宽检测线性范围且特异检测苹果酸含量的酶传感电极。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种共固定NOX（NADH氧化酶）和MDH（苹果酸脱氢酶）的苹果酸传感电极。采用这两种酶耦合制备的苹果酸传感电极，具有较宽的线性检测范围，可以直接应用于的高浓度苹果酸的检测，为后续开发苹果酸在线检测设备奠定了理论与应用基础。
[0005]为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种具有宽检测线性范围的苹果酸传感电极，包括基底电极和利用固定化载体共固定于电极表面的NADH氧化酶和苹果酸脱氢酶。
[0006]作为一种优选的实施方式，所述基底电极经普鲁士蓝修饰。
[0007]作为一种优选的实施方式，所述固定化载体为壳聚糖。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供上述苹果酸传感电极的制备方法，包括：将NADH氧化酶的酶液、苹果酸脱氢酶的酶液与壳聚糖溶液混合得到混合液后，将混合液滴定于基底电极上并干燥，得到所述苹果酸传感电极。
[0009]作为一种优选的实施方式，所述壳聚糖溶液中壳聚糖质量分数为0.5~5%；壳聚糖溶液和酶液按体积比1：0.8~1.2混合。优选的，所述壳聚糖溶液中壳聚糖质量分数为1.25%；壳聚糖溶液和酶液按体积比1：1混合。
[0010]作为一种优选的实施方式，所述NADH氧化酶的酶液的获取方式为：构建可表达NADH氧化酶的基因工程菌株，发酵所述基因工程菌株得到发酵得到NADH氧化酶的粗酶液，将粗酶液纯化后得到的纯酶制成所述酶液。
[0011]作为一种优选的实施方式，所述基因工程菌株的构建方式为：将编码NADH氧化酶的基因序列合成并构建至质粒pET
‑
28a上，酶切位点为Nde I和
Xho I，获得重组质粒；将重组质粒转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中，得到基因工程菌株，即NADH氧化酶生产菌。
[0012]进一步的，将所述基因工程菌株接种于LB培养基中，加入诱导剂诱导表达NADH氧化酶；离心收集菌体后，洗涤、离心、破碎、收集上清液，即为NADH氧化酶的粗酶液；纯化所述粗酶液得到纯化的NADH氧化酶。
[0013]作为一种优选的实施方式，粗酶液纯化的过程为：将粗酶液与Ni柱进行特异性结合，并用咪唑溶液洗脱，得到含有目的蛋白的洗脱液；再将含有目的蛋白的洗脱液通过超滤管离心富集，得到纯化的NADH氧化酶。
[0014]作为一种优选的实施方式，所述混合液中NADH氧化酶和苹果酸脱氢酶的酶活比例为1：1。
[0015]作为一种优选的实施方式，所述基底电极为普鲁士蓝修饰电极，制备方式如下：将基底电极进行表面预处理后置于气溶胶沉积箱中；将阴离子溶液和KCl溶液雾化成气溶胶后通入气溶胶沉积箱，反应若干时间；将阳离子溶液和KCl溶液雾化成气溶胶后通入气溶胶沉积箱，反应若干时间；取出电极烘干后得到所述普鲁士蓝修饰电极；所述阴离子溶液为K4Fe(CN)6或K3Fe(CN)6；阳离子溶液为FeCl3或(NH4)2Fe(SO4)2。
[0016]作为一种优选的实施方式，将所述混合液于3～6℃下避光放置至干燥，将6 μL混合液滴定于普鲁士蓝修饰电极上，得到所述苹果酸传感电极。
[0017]本专利技术的又一目的在于提供上述苹果酸传感电极在苹果酸检测中的应用。
[0018]一种优选的应用方式为：以所述苹果酸传感电极作为工作电极，使用三电极系统进行检测，检测环境为PBS缓冲液，并加入黄素单核苷酸和NAD+，采用计时安培法进行测试。
[0019]与现有技术相比，本专利技术提供的基于NOX和MDH的苹果酸生物传感器的传感电极的方法，采用壳聚糖将NOX和MDH固定在普鲁士蓝修饰后的电极表面。采用本方法制备的苹果酸生物传感电极及含有该电极的传感器线性检测上限较高，弥补了发酵生产中高浓度苹果酸无法直接检测的缺陷，也为后续开发苹果酸在线检测设备奠定了理论与应用基础。
附图说明
[0020]图1是NOX和MDH的SDS
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PAGE图。
[0021]图2是实施例2制备的传感电极的抗干扰性测试。
[0022]图3是实施例2制备的传感电极对不同浓度的苹果酸浓度—电流响应标准曲线。
[0023]图4是实施例2制备的传感电极对不同浓度的苹果酸浓度—电流响应标准曲线。
具体实施方式
[0024]本专利技术中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本专利技术实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本专利技术的范围之外。本专利技术中未提及的组分的来源均为市售。
[0025]下面结合附图和具体实例对本专利技术进行详细说明，可以帮助更好地理解本专利技术。
实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。并对本专利技术提供技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，并非对其保护范围的限制。
[0026]实施例中使用的MDH为商业化酶制剂，购自上海源叶生物科技有限公司。该MDH产品的SDS
‑
PAGE图如图1所示，1泳道的两根条带是MDH的两种聚合状态，一种为单体，一种为同源二聚体。实施例中使用的NOX基因来自Thermus thermophilus HB8，其Genbank登录号为NC_006461.1。
[0027]实施例中使用的普鲁士蓝修饰电极按专利CN101532979A中公开的方法制备得到，包括：（1）将基底电极进行打磨、超声等表面预处理后置于气溶胶沉积箱中；（2）阴离子溶液0 .01～2 M K
4 Fe(CN)6或K
3 Fe(CN)6和0 .01～0 .5 M KCl溶液经超声雾化器雾化成气溶胶后，通入气溶胶沉积箱中，反应若干时间；（3）等浓度阳离子溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有宽检测线性范围的苹果酸传感电极，其特征在于，包括基底电极和利用固定化载体共固定于电极表面的NADH氧化酶和苹果酸脱氢酶。2.根据权利要求1所述的苹果酸传感电极，其特征在于，所述基底电极经普鲁士蓝修饰。3.根据权利要求1所述的苹果酸传感电极，其特征在于，所述固定化载体为壳聚糖。4.权利要求1~3任一项所述苹果酸传感电极的制备方法，其特征在于，包括：将NADH氧化酶的酶液、苹果酸脱氢酶的酶液与壳聚糖溶液混合得到混合液后，将混合液滴定于基底电极上并干燥，得到所述苹果酸传感电极。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液中壳聚糖质量分数为0.5~5%；壳聚糖溶液和酶液按体积比1：0.8~1.2混合。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述NADH氧化酶的酶液的获取方式为：构建可表达NADH氧化酶的基因工程菌株，发酵所述基因工程菌株得到发酵得到NADH氧化酶的粗酶液，将粗酶液纯化后得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：周杰，彭雨晴，姜岷，杨璐，董维亮，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：