本发明专利技术适用于医药技术领域，提供了一种年轻骨细胞来源的细胞外囊泡的制备方法及其在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。本发明专利技术通过实验证实年轻骨细胞来源的细胞外囊泡在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。同时提供了年轻骨细胞来源的细胞外囊泡的制备方法。本发明专利技术用2月龄的年轻骨细胞来源的细胞外囊泡干预的4月龄的APP/PS1小鼠表现出更好的认知功能、脑组织中Aβ斑块减少、突触损害减少和神经元丢失减少；而16月龄的骨细胞来源的细胞外囊泡干预组在体外和体内实验中没有明显差异，这表明骨细胞来源的细胞外囊泡的保护作用随着年龄的增长而下降。综上可知，年轻骨细胞来源的细胞外囊泡可以在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。中的应用。中的应用。
【技术实现步骤摘要】
年轻骨细胞来源的细胞外囊泡的制备方法及其在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用
[0001]本专利技术属于医药
，尤其涉及一种年轻骨细胞来源的细胞外囊泡的制备方法及其在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。
技术介绍
[0002]阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种起病隐匿、逐渐进展的神经退行性疾病，也是老年人最常见的痴呆亚型，其主要临床特征是以情景记忆为主的认知功能进行性下降。骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是以骨量进行性下降、骨微结构退化、骨脆性增加和易发生骨折为特征的一种全身性代谢性疾病。AD和OP都是与衰老相关的常见退行性疾病，在临床流行病学上密切相关。多项研究报道阿尔茨海默症患者的骨密度(Bone mineral density，BMD) 较低且骨质疏松症的发生频率较高，低BMD也与AD发生的风险增加相关。目前，大脑和骨骼之间信号传递方面的研究还很少。近年来，研究发现细胞外囊泡 (Extracellular vesicles，EVs)是介导原核生物和高等真核生物细胞间生物信号交换的主要因素，骨细胞来源的细胞外囊泡(Osteocyte
‑
derivedextracellular vesicles，OCY
‑
EVs)可介导骨与非骨骼器官之间的功能调控。本研究将探索OCY
‑
EVs在大脑与骨骼之间的信息传递作用，以及OCY
‑
EVs对AD 的作用。
技术实现思路
[0003]本专利技术实施例提供一种年轻骨细胞来源的细胞外囊泡的制备方法及其在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用，旨在解决现有技术的AD药物进入脑中存在血脑屏障和AD的治疗只能延缓症状的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提出如下技术方案：
[0005]年轻骨细胞来源的细胞外囊泡在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。
[0006]所述年轻骨细胞来源的细胞外囊泡为2月龄的骨细胞来源的细胞外囊泡。
[0007]所述的年轻骨细胞来源的细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
[0008]1)将原代骨细胞的在骨细胞无外泌体培基中培养；隔天换液，收集细胞培基于
‑
80℃保存；
[0009]2)在4℃下以300
×
g离心10分钟，取第一上清；将第一上清在4℃下以 2000
×
g离心30分钟，取第二上清；在4℃下以10000
×
g离心30分钟，取第三上清；
[0010]3)将第三上清用无菌0.22μm过滤器过滤，以去除残留的细胞碎片；
[0011]4)将过滤后的上清液转移到超离管中，在4℃下以100000
×
g离心10小时，收集管底部有沉淀，弃去上清；用PBS重悬沉淀；获得年轻骨细胞来源的细胞外囊泡(OCY
‑
EVs)。
[0012]步骤1)中所述骨细胞无外泌体培基，具体组分为：α
‑
MEM细胞培基 44.5mL；无外泌体FBS 5mL；P/S双抗0.5mL。
[0013]步骤4)中获得的年轻骨细胞来源的细胞外囊泡若不立即使用，可分装储存在
‑
80
℃，避免多次冻融。
[0014]步骤1)中所述的原代骨细胞的获取，具体包括以下步骤：
[0015](1)将小鼠放至75％乙醇浸泡2分钟，取股骨、胫骨、肱骨放入含1％P/S 的PBS的无菌细胞培养皿中；
[0016](2)用镊子和剪刀去除骨上附着的肌肉；用手术刀片刮去骨膜；剪去骨骺两端，用研钵挤压，PBS反复冲洗，以去除骨髓；
[0017](3)尽可能将骨剪碎，使其成为大小0.8
‑
1.2mm的骨片；PBS反复冲洗，直至液体变成无色，去除残存的骨髓；
[0018](4)骨片中加入Ⅱ型胶原酶消化液，置于37℃摇床80rpm/min避光消化 30分钟；弃去Ⅱ型胶原酶消化液，PBS洗3次；
[0019](5)重复步骤(4)两次；
[0020](6)加入5mM pH＝7.4的EDTA溶液，置于37℃摇床80rpm/min避光消化30分钟；PBS洗3次；
[0021](7)依次重复按照步骤(4)和步骤(6)条件进行消化处理，重复两次；
[0022](8)细胞培养瓶中加3mLⅠ型鼠尾胶原蛋白溶液铺板，放入37℃细胞培养箱孵育30分钟；
[0023](9)骨片中加入Ⅱ型胶原酶消化液，置于37℃摇床80rpm/min避光消化 30分钟；弃去Ⅱ型胶原酶消化液，PBS洗3次；去除PBS，将骨片剪更碎；
[0024](10)将骨片转移至铺板后的细胞培养瓶，加入6mL骨细胞完全培养基，将骨片摇匀，放入细胞培养箱，静置7天；
[0025](11)7天后取出T25细胞培养瓶，在光学显微镜下可观察到骨片周围有骨细胞爬出，获得原代骨细胞。
[0026]步骤(4)中所述Ⅱ型胶原酶消化液，具体组分为：α
‑
MEM细胞培基48.5 mL；FBS 1mL；Ⅱ型胶原酶原液500μL；所述Ⅱ型胶原酶原液为1mg/mL。
[0027]步骤(8)中所述Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液，具体组分为：PBS 48mL；冰醋酸60μL；Ⅰ型鼠尾胶原蛋白原液2mL；所述Ⅰ型鼠尾胶原蛋白原液为 3.59mg/mL。
[0028]步骤(10)中所述骨细胞完全培养基，具体组分为：α
‑
MEM细胞培基 44.5mL；FBS 2.5mL；CS 2.5mL；P/S双抗0.5mL。
[0029]步骤(10)中所述细胞培养箱的条件为37℃，5％CO2，饱和湿度。
[0030]本专利技术所达到的有益效果：
[0031]1.本专利技术的实验结果表明，用年轻骨细胞(2月龄)来源的细胞外囊泡干预的4月龄的APP/PS1小鼠表现出更好的认知功能、脑组织中Aβ斑块减少、突触损害减少和神经元丢失减少；而16月龄的骨细胞来源的细胞外囊泡干预组在体外和体内实验中没有明显差异，这表明骨细胞来源的细胞外囊泡的保护作用随着年龄的增长而下降。综上可知，年轻骨细胞来源的细胞外囊泡可以在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。
[0032]2.目前临床上已经应用的AD的治疗方法是比较有限的，而本专利技术研究的结果为AD的治疗药物提供了一个新的思路。随着工程化EV技术的发展，我们可以人工合成细胞外囊泡，通过将年轻OCY
‑
EV中的关键成分精确包装到人工 EV中，产生一种新型的治疗试剂。鉴于EV本身可以穿过血脑屏障以及靶向定位的特点，其有望成为一种高效、靶向的AD治疗药
物。
附图说明
[0033]图1为OCY
‑
EVs干预4M APP/PS1小鼠后行为学结果图；其中：A：实验设计示意图，其中注明了干预和检测的时间点；B
‑
E：OCY
2M
‑
...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.年轻骨细胞来源的细胞外囊泡在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。2.根据权利要求1所述的年轻骨细胞来源的细胞外囊泡在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用，其特征在于：所述年轻骨细胞来源的细胞外囊泡为2月龄的骨细胞来源的细胞外囊泡。3.权利要求1的应用中所述的年轻骨细胞来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将原代骨细胞的在骨细胞无外泌体培基中培养；隔天换液，收集细胞培基于
‑
80℃保存；2)在4℃下以300
×
g离心10分钟，取第一上清；将第一上清在4℃下以2000
×
g离心30分钟，取第二上清；在4℃下以10000
×
g离心30分钟，取第三上清；3)将第三上清用无菌0.22μm过滤器过滤，以去除残留的细胞碎片；4)将过滤后的上清液转移到超离管中，在4℃下以100000
×
g离心10小时，收集管底部有沉淀，弃去上清；用PBS重悬沉淀；获得年轻骨细胞来源的细胞外囊泡。4.根据权利要求3所述的年轻骨细胞来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述骨细胞无外泌体培基，具体组分为：α
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MEM细胞培基44.5mL；无外泌体FBS 5mL；P/S双抗0.5mL。5.根据权利要求3所述的年轻骨细胞来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于：步骤4)中获得的年轻骨细胞来源的细胞外囊泡分装储存在
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80℃。6.根据权利要求3所述的年轻骨细胞来源的细胞外囊泡的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的原代骨细胞的获取，具体包括以下步骤：(1)将小鼠放至75％乙醇浸泡2分钟，取股骨、胫骨、肱骨放入含1％P/S的PBS的无菌细胞培养皿中；(2)用镊子和剪刀去除骨上附着的肌肉；用手术刀片刮去骨膜；剪去骨骺两端，用研钵挤压，PBS反复冲洗，以去除骨髓；(3)尽可能将骨剪碎，使其成为大小0.8
‑
...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈璐，谢辉，江亚凌，王振兴，焦彬，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：
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