一种鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA快速检测试剂盒以及对鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)检测方法。本发明专利技术具有定量、检测浓度范围大、重复性好、操作简便等优点。等优点。等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
涉及一种抗原检测试剂盒，具体的涉及一种鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]血管紧张素转换酶2(ACE2)是2000年发现的ACE同系物中的一员，是肾素
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血管紧张素系统的一个重要调节因子。属于I型跨膜糖蛋白，一种含锌离子的单羧基肽糖蛋白酶。广泛存在于动物的心脏、肝脏、肺脏、肾脏、睾丸以及肠道等主要器官中。ACE2将血管紧张素II(AngII)降解为具有舒张血管及抗增殖作用血管紧张素(1
‑
7)[Ang(1
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7)]，也可将血管紧张素I(AngI)降解为Ang(1
‑
9)。Ang(1
‑
7)通过其受体Mas(MasR)发挥抗氧化、抗纤维化、抗炎等作用，引起了科研工作者的广泛关注。
[0003]自从发现血管紧张素转换酶2(ACE2)的基本生物学和生理学知识以来，对它的研究不断深入，并进一步促进着对肾素
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血管紧张素系统(RAS)的理解。围绕血管紧张素转化酶(ACE2)研究主要有三个方面：肾素
‑
血管紧张素系统(RAS)的负调节剂，氨基酸转运的促进剂以及SARS
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CoV和SARS
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CoV
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2受体。ACE2广泛表达在肺，心血管系统，肠，肾，中枢神经系统和脂肪组织中。
[0004]多年来对ACE2的研究已见于人类、动物猪、羊等，但在鸭上的研究缺少资料和相应的检测方法。本研究首次用自制的鸭ACE2重组蛋白作为免疫抗原，制备了多克隆抗体，在此基础上建立了鸭ACE2含量检测的双抗夹心ELISA方法，建立的方法快速、灵敏、特异性好，可用于鸭血液、组织匀浆液ACE2含量的检测。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本研究通过重组表达鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)蛋白，制备兔源多克隆抗体、鼠源多克隆抗体，进一步利用双抗体夹心ELISA法研制了一种快速检测鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)的双抗体夹心Elisa试剂盒，快速检测ACE2。
[0007]为达到上述目的，本专利技术采用一种技术方案：一种鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)的双抗体夹心ELISA试剂盒，包括：包被捕获抗体的酶标板，封闭液，洗涤液，底物显色液，终止液以及检测抗体。
[0008]本专利技术涉及的抗鸭ACE2蛋白多克隆抗体由蛋白纯化后免疫大鼠、新西兰大白兔获得。
[0009]利用所述鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)的双抗体夹心EL ISA试剂盒检测鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)的方法，其步骤如下：
[0010](1)捕获抗体的包被：用包被液将捕获抗体(鼠抗鸭ACE2多克隆抗体)按1∶1600(3.5μg/mL)稀释后加入96孔板中，每孔100μL，4℃包被过夜。
[0011](2)封闭：倒掉包被液，每孔加入100μL5％BSA，4℃下封闭过夜。
[0012](3)加入待检测抗原：标品/样本100ul，37℃下孵育1h。
[0013](4)捕获抗体孵育：抗原稀释液，拍打干净残留液体，加入洗涤缓冲静置3min后打干净洗涤液，重复三次。每孔加入100L按1∶200(17μg/mL)稀释的兔抗鸭ACE2多克隆抗体(HRP标记)，37℃孵育1.5h。
[0014](5)显色：倒掉二抗，拍打干净残留液体，洗涤缓冲液洗涤三次，每次三分钟，每次尽量拍打干净残留液体。每孔加入100LTMB显色剂，，37℃孵育1.5h。
[0015](6)终止反应：每孔加入100uL的终止液，在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。
[0016](7)标准方程的建立：使用酶标仪测定已知浓度的鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)得到对应的0D
450
‑
ACE2浓度对数值，拟合得出线性标准线性方程；
[0017](8)待测样品的测定：将测得的OD450值作为x值代入方程，计算出的y值，y值为ACE2浓度(ng/ml)的对数值，进而计算出待测样品中ACE2的浓度。
[0018]现有技术相比，本专利技术的有益效果至少在于：试剂盒中，作为检测标记物ACE2的多克隆抗体，标记条件成熟稳定无毒，试剂盒本身分辨率、灵敏度、稳定较强，可做定量检测。
[0019]本专利技术的ACE2双抗体夹心ELISA快速检测试剂盒及检测系统，操作简单直接加血清样本、检测时间短，适合于推广使用，克服了现有化学发光法，价格昂贵，检测耗时且需要投入专业操作人员的缺点，能独立处理数据从而定量检测的优点。
[0020]为了实现本专利技术，对一系列实验进行了优化。包括：优化了抗体最佳工作浓度、包被条件、封闭条件、孵育条件和显色时间。
[0021]将多抗血清分别做倍比稀释进行方阵ELISA滴定，以其中OD450nm最接近1的孔为最佳抗体稀释浓度，确定捕获抗体(鼠抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶1600(3.5μg/mL)，检测抗体(兔抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶200(17μg/mL)。
[0022]分别用脱脂乳和BSA为封闭液进行封闭，结果表明5％BSA 4℃封闭过夜时P/N值最大，故选用此条件为最佳封闭条件。采用单因素变量法，分别对待检样品、检测样品孵育时间、显色时间等进行比较，以P/N值最大为判定标准，最终确定待检样品作用时间1h、检测样品作用时间1.5h，37℃显色15min为最佳反应条件。
[0023]用制备的鸭ACE2纯化重组蛋白抗原作标准品，设置标准品浓度依次为至1600ng/mL、800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL，建立了标准曲线，可以定性检测样本中抗原含量。最低检测浓度为25ng/mL。
[0024]本专利技术与现有技术相比，具有以下优势；
[0025]1.本专利技术试剂盒具有良好的重复性。批内实验变异系数为1.65％～5.62％，批间实验变异系数为3.66％～6.81％，变异系数均在10％以内，显示重复性好；
[0026]2.本专利技术试剂盒有较宽的检测浓度区间。从25ng/mL
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1600ng/mL均可准确检测ACE2浓度；
[0027]3.本专利技术试剂盒为特有检测鸭物种ACE2浓度，填补了缺少定量检测鸭物种ACE2浓度的空白；
[0028]4.本专利技术可以定量检测样品中ACE2蛋白含量，最低检测值为25ng/mL；
[0029]5.本专利技术试剂盒与目前常用的Western Blot、免疫荧光及荧光定量PCR等方法相比，检测周期短、操作简便、人员技术水平要求低、主观因素误差小、设备简单、可以快速实
现大批量样品的检测分析。
附图说明...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸭ACE2双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于：包被有抗鸭ACE2蛋白多克隆抗体的酶标板、封闭液、HRP酶标ACE2多抗、浓缩洗涤液、显色液、终止液、标准品。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包被稀释液为碳酸盐缓冲液。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：抗体的最佳包被温度为37℃孵育1h后4℃过夜。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述所述封闭液为含5％BSA，37℃封闭1h。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：捕获抗体(鼠抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶1600(3.5μg/mL)。检测抗体(兔抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶200(17μg/mL)。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：检测抗体(兔抗ACE2多克隆抗体)最佳稀释倍数为1∶200(17μg/mL)。7.权利要求1所述的试剂盒在鸭ACE2含量检测的应用。8....

【专利技术属性】
技术研发人员：张源淑，李帅，谢娜娜，纪晓霞，朱斌，张崇昊，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：