基于单细胞测序的非单精子判定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于单细胞测序的非单精子判定方法，属于生殖技术领域，包括如下步骤：（1）对待测样本家系中不少于2个精子的样本作为参照进行测序，统计这些样本常染色体单核苷酸多态性位点并统计单核苷酸多态性位点的杂合比例，得到参照样本平均杂合比例；（2）对待测样本进行测序，计算其单核苷酸多态性位点的杂合比例；（3）当待测样本的杂合比例为参照样本平均杂合比例的2倍以上时，所述待测样本为非单精子；其中，杂合比例=单核苷酸多态性位点杂合位点数量/（单核苷酸多态性位点杂合位点数量+单核苷酸多态性位点纯合位点数量）。本发明专利技术解决了以往通过拷贝数变异分析只能判定XY类型的非单精子的问题。类型的非单精子的问题。类型的非单精子的问题。

【技术实现步骤摘要】
基于单细胞测序的非单精子判定方法


[0001]本专利技术属于生殖
，具体涉及基于单细胞测序的非单精子判定方法。

技术介绍

[0002]胚胎着床前遗传学检测是通过体外受精的方式获得胚胎，并活检少量胚胎细胞用于胚胎中遗传异常检测的一种手段。着床前遗传学检测一般通过连锁分析挑选不携带致病突变的胚胎并移植，从而帮助患者生育健康后代。
[0003]连锁分析是单基因病胚胎着床前遗传学检测的重要环节，在进行连锁分析的计算时，需要先利用家系成员或对于男方携带致病突变而没有其他成员时采用单精子确定单体型。而对于精子来说，现有分析方法通常直接默认其为单倍体。由于在实际的临床实践过程中，有时会出现显微操作技术的失误或所取精子为未完成减数分裂的二倍体（46,XX；46,XY），从而导致连锁分析的计算过程可能存在异常。大多情况下，若
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单精子”的染色体非整倍体检测结果同时出现了X和Y，则可认为该样本为非单精子。但是由于现有的计算方法，无法将46,XX与23,X进行区分，则可能导致46,XX的精子样本被错判为正常单精子。
[0004]显微操作通常使用上泳法与密度梯度离心法分离精子，将显微视野中的精子控制在个位数的量级，随后用同一注射针逐一吸取“单精子”。在转移过程中可能存在肉眼判断精子数量的失误、转移时精子未被吹出或贴在针头上与下一精子一同吹出的情况。并且单个精子内也可能存在染色体数量异常，而实验人员无法直接通过精子形态进行判断。因此目前的已有方法主要存在的缺陷是，可能导致后续连锁分析结果存在误判的风险。因此在进行连锁分析前能够确定样本是否为单精子以及其是否为单倍体至关重要。
[0005]中国专利CN105543339B公开了一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法，具体包括胚胎细胞样本的获取、全基因组扩增、目的基因突变位点扩增、全基因组扩增产物及目的基因突变位点的建库、高通量测序和数据分析各主要步骤，通过利用全基因组扩增技术结合高通量测序，一步完成多项综合性检测，避免了使用多方法、多步骤分别进行单基因遗传病突变位点、染色体疾病和连锁分析的检测。该专利技术所提供的方法为微量样本提供了有利条件，不仅可用于着床前遗传学检测，确定胚胎是否携带致病基因和染色体拷贝数异常情况；也适用于反复流产、高龄妇女胚胎的遗传性筛选，实现一个步骤完成单个样本多项检测。
[0006]中国专利技术专利申请CN105420395A公开了一种单精子多重PCR检测方法，包括以下步骤：A、精子预处理，B、显微操作挑取单个精子以及C、单精子多重PCR。该专利技术专利申请所涉及的单精子多重PCR检测方法突破了以往对微量细胞的遗传病基因检测只能针对女性卵子和胚胎的局限性，使分析男性生殖细胞是否为嵌合成为可能。通过该专利技术方法可以检测到在体细胞和群体精子中无法检测的、仅在单个精子中存在的极罕见的自发突变；能对父亲生殖细胞新生突变引起的父亲年龄效应系列遗传病进行新生突变的辅助诊断分析，在此基础上联合胚胎着床前遗传学诊断技术，预防阻断该类遗传病患儿出生的风险。
[0007]使用单精子进行连锁分析在实际诊断过程中具有重要价值，然而，目前缺乏判定
所取精子样本为单精子且为单倍体的鉴定方法，本专利技术旨在提供一种利用单细胞测序结果判定样本是否为非单精子的判定方法。

技术实现思路

[0008]基于上述原因，本专利技术提出利用样本的单细胞二代测序数据，通过计算SNP（单核苷酸多态性）位点杂合度判断非单精子情况，利用单细胞测序结果判定样本是否为非单精子的判定方法。具体而言，为了实现本专利技术的目的，本专利技术拟采用如下的技术方案：本专利技术涉及一种非单精子判定方法，其特征在于包括如下步骤：（1）对待测样本家系不少于2个精子（作为参照）的样本进行测序，统计其常染色体SNP位点数量并统计SNP的杂合位点比例，得到参照样本平均杂合比例；（2）对待测样本进行测序，计算其SNP位点的杂合比例；（3）当待测样本的杂合比例为参照样本平均杂合比例的2倍以上时，判定所述待测样本为非单精子；其中，杂合比例=杂合SNP位点数量/（杂合SNP位点数量+纯合SNP位点数量）。
[0009]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述SNP位点为所有精子（包括参照样本和待测样本）的全部染色体的SNP位点。通过对全部染色体的杂合度进行评估，可以提高对于SNP杂合度判断的准确性。
[0010]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述SNP位点为所有精子（包括参照样本和待测样本）的单条染色体的SNP位点。通过对单条染色体的杂合度进行评估，可以减小分析时间，提高判定效率。
[0011]在本专利技术的一个优选实施方式中，所有样本均只选取1G的原始测序量进行SNP计算。通过该优选的实施方式，在保证覆盖度和SNP获取量的前提下，减小了数据分析的偏倚。
[0012]在本专利技术的一个优选实施方式中，所有样本均使用MALBAC（多次退火环状循环扩增技术）扩增后DNA建库测序。由于MALBAC扩增为拟线性扩增，且具有特定的扩增模式，该方法降低了不同样本间、不同批次间的扩增差异。
[0013]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述方法还包括检测待测样本的CNV（拷贝数变异）结果。该优选的实施方式通过进行SNP位点杂合度分析，并结合CNV结果，对精子样本是否为单精子进行评估，保证了后续连锁分析的准确性。有益效果本专利技术提出了通过常染色体SNP的杂合度判断精子样本是否为单倍体的新思路，解决了以往通过CNV的方法，只能看XY类型的非单精子的问题。通过对精子样本的二代测序结果的全部常染色体或某条染色体SNP进行统计分析，计算出SNP杂合度，以评估样本是否为单倍体，进而提高后续连锁分析的准确性。
附图说明
[0014]图1为家系1精子样本的基因组CNV情况；图2为家系2精子样本的基因组CNV情况；图3为家系3精子样本的基因组CNV情况；图4为家系4精子样本的基因组CNV情况。
具体实施方式
[0015]为了进一步理解本专利技术，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0016]如无特殊说明，本专利技术实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例1：基于单细胞测序的非单精子计算方法的构建1. 通过显微操作所得精子样本，裂解精子样本，使用商业化MALBAC单细胞全基因组扩增试剂盒进行单细胞DNA扩增。
[0017]2. 扩增后的DNA进行二代测序建库。使用illumina测序仪进行双端150bp测序，平均每个样本数据量为2G。下机后得到每个样本的二代测序reads数据。
[0018]3. 所得测序reads，使用trim_galore软件去除接头序列、低质量碱基以及长度小于等于36bp的测序reads。
[0019]4. 为确保样本的测序量保本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非单精子判定方法，其特征在于包括如下步骤：（1）首先对待测精液样本中不少于2个精子的样本作为参照进行测序，统计其常染色体SNP位点并计算SNP位点的杂合比例，得到参照样本的平均杂合比例；其中，SNP是指单核苷酸多态性；（2）对待测精子样本进行测序，计算其SNP位点的杂合比例；（3）当待测样本的杂合比例为参照样本平均杂合比例的2倍以上时，所述待测样本为非单精子；其中，杂合比例=杂合SNP位点数量/（杂合SNP位点数量+纯合SNP位点数量...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫丽盈，严智强，朱小辉，乔杰，李汉娜，王楠，马陌尘，龙川，智旭，迟洪斌，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：