利用混菌体系实现木质纤维素从头合成丁酸丁酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用混菌体系实现木质纤维素从头合成丁酸丁酯的方法，包括将活化的棘孢木霉接种至以木质纤维素为碳源的发酵培养基中好氧发酵48

【技术实现步骤摘要】
利用混菌体系实现木质纤维素从头合成丁酸丁酯的方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用混菌体系实现木质纤维素从头合成丁酸丁酯的方法。

技术介绍

[0002]丁酸丁酯是一种应用广泛的短链脂肪酸酯，作为溶剂广泛用于有机合成过程；此外，丁酸丁酯在低温下具有与航空柴油相似的理化性质，可直接用作航空燃料，是一种更高附加值的燃料添加剂。丁酸丁酯天然存在于菠萝、香蕉和草莓等水果中，然而含量非常低。传统生产工艺以丁酸和丁醇为原料、浓硫酸为催化剂，通过酯化反应合成，该工艺虽然技术成熟、产品收率高，但存在副反应多、设备腐蚀严重、“三废”排放量大等弊端。利用脂肪酶催化合成丁酸丁酯，产品纯度高，然而收率较低、底物和酶成本较高，限制了其大规模应用。因此，迫切需要开发新型生产工艺，实现丁酸丁酯的高效合成。生物发酵法合成丁酸丁酯能以可再生的生物质为原料，具有反应条件温和、产品纯度高、过程绿色环保等优势；且生物发酵合成的丁酸丁酯更受消费者青睐（约1100元/千克），其价格要远远高于化学合成的丁酸丁酯（约 60元/千克），因此，在食用香精和日化香料等领域具有更广泛的市场。
[0003]木质纤维素类生物质是继煤炭、石油、天然气等化石能源之后最重要的可应用能源之一，被认为世界第四大能源。随着开采型不可再生资源的日趋枯竭，木质纤维素类生物质原料的资源优势愈发显现。棘孢木霉是可以直接利用木质纤维素为碳源进行生长发酵的丝状真菌。棘孢木霉能够在发酵1~2天内迅速的生长，并分泌大量纤维素酶、半纤维素酶和β
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葡萄糖苷酶，可以高效降解未经任何化学或生物处理的玉米芯等木质纤维素类原料，在木质纤维素降解方面有着极高的应用价值。
[0004]混菌发酵是指采用两种或多种微生物的协同作用共同完成某发酵过程的一种新型发酵技术，可通过菌株间的“劳动分工”实现复杂代谢任务。目前对于具有合作关系的菌株筛选和组合还是一个随机的过程，缺乏有效的理论指导，而且对于已经应用的混菌培养体系也不能有效地协调菌株间的关系，使其达到最佳生态水平，发挥最大效应，这严重阻碍了混菌发酵的发展和应用。通过“师法自然”策略，从自然界中筛选可以直接利用木质纤维素合成丁酸、丁醇的天然菌群，并通过对其中核心功能菌株的筛选，构建跨种属的功能互补混菌发酵体系，有助于提升菌群间的有效合作，提高通过一体化生物加工过程利用木质纤维素类原料直接合成丁酸丁酯的合成效率。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供通过微生物混菌体系实现从木质纤维素从头合成丁酸丁酯的方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种利用混菌体系实现木质纤维素从头合成丁酸丁酯的方法，包括：（1）将活化的棘孢木霉接种至以木质纤维素为碳源的发酵培养基中好氧发酵48
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120 h；（2）将活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种步骤（1）得到的发酵液中厌氧发酵；（3）向步骤（2）得到的发酵液中添加脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液或菌体沉淀，合成丁酸丁酯，发酵完毕后萃取得到丁酸丁酯产品；其中，所述脂肪酶表面展示大肠杆菌为将脂肪酶lipA的编码基因和锚定蛋白estA的编码基因克隆到表达载体上后，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选得到的阳性克隆。
[0007]作为一种优选的实施方式，所述棘孢木霉为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）LYS1；所述丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）ATCC 824；所述酪丁酸梭菌为酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）ATCC 25755。棘孢木霉LYS1菌株能够在发酵1~2天内迅速的生长，并分泌大量纤维素酶、半纤维素酶和β
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葡萄糖苷酶，其中β
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葡萄糖苷酶酶活优于里氏木霉，能有效弥补目前商业菌株β
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葡萄糖苷酶分泌不足的问题，高效降解微晶纤维素；而且基于较高的半纤维素酶分泌能力，该菌株还能高效降解未处理的玉米芯等木质纤维素类原料，在木质纤维素降解方面有着极高的应用价值。丙酮丁醇梭菌ATCC 824是ABE发酵中典型的高产丁醇菌株的代表，其整个发酵过程可以分为产酸产溶剂两阶段，其在产酸阶段消耗24
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40 %的糖，生成4
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6 g/L有机酸（乙酸、丁酸）。当发酵液pH值下降到时一定值时，酸开始向溶剂转化，虽然溶剂（丁醇、乙醇）不断生成，但是酸的浓度基本维持不变。其可在ABE发酵后期可合成高浓度的丁醇（18.65 g/L），酶活检测发现，菌株可内源性表达脂肪酶。酪丁酸梭菌属于革兰氏阳性芽孢杆菌，有机化能专性厌氧型。以五碳糖或六碳糖作为碳源底物发酵时，其主要产物为丁酸，同时生成乙酸、二氧化碳和氢气等副产物。对强酸、高温、高盐等恶劣环境具有较高的耐受性，生命力较强，并且具有培养条件相对简单，丁酸产量、得率、纯度相对较高、发酵稳定性较好等优点，此外其发酵副产物氢气也是一种清洁、高效的绿色能源，因此被认为是最具商业化开发潜力的产丁酸菌株。
[0008]作为一种优选的实施方式，厌氧发酵24 h后添加所述菌体沉淀。
[0009]作为一种优选的实施方式，好氧发酵48
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72 h后接种活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌。更进一步地优选为发酵40小时，将活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，发酵液中有一定量葡萄糖，且纤维素酶和β
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葡萄糖苷酶的活性较高，能够持续降解微晶纤维素为葡萄糖，而丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌可以利用降解得到的葡萄糖生产丁酸丁酯。接种时间过早（24 h），纤维素酶的酶活较低，不利用后续微晶纤维素的降解；接种时间过晚（棘孢木霉发酵72
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120 h），则会导致棘孢木霉培养时间过长，纤维素酶和β
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葡萄糖苷酶分泌量减少，酶系的酶活下降，且部分降解得到的葡萄糖也被棘孢木霉利用，从而减少了丁酸丁酯的碳流量，最终导致丁酸丁酯产量降低。因此，丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌的接种时间是混菌发酵生产丁酸丁酯极为关键的步骤。
[0010]作为一种优选的实施方式，所述木质纤维素浓度为60
‑
120 g/L。
[0011]作为一种优选的实施方式，所述木质纤维素来源为玉米芯或微晶纤维素。
[0012]作为一种优选的实施方式，所述活化的棘孢木霉的接种量为发酵培养基体积的1
‑
5%。
[0013]作为一种优选的实施方式，所述活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌的接种量为发酵液体积的1
‑
10%。
[0014]作为一种优选的实施方式，所述棘孢木霉活化方式为：
取棘孢木霉菌液涂覆于PDA固体培养基中培养72
‑
120 h，取培养基上菌落接种于活化培养基，于28
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35 ℃活化24
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96 h；所述活化培养基配方为：0.1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用混菌体系实现木质纤维素从头合成丁酸丁酯的方法，其特征在于，包括：（1）将活化的棘孢木霉接种至以木质纤维素为碳源的发酵培养基中好氧发酵48
‑
120 h；（2）将活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种步骤（1）得到的发酵液中厌氧发酵；（3）向步骤（2）得到的发酵液中添加脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液或菌体沉淀，合成丁酸丁酯，发酵完毕后萃取得到丁酸丁酯产品；其中，所述脂肪酶表面展示大肠杆菌为将脂肪酶lipA的编码基因和锚定蛋白estA的编码基因克隆到表达载体上后，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选得到的阳性克隆。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述棘孢木霉为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）LYS1；所述丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）ATCC 824；所述酪丁酸梭菌为酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）ATCC 25755。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，厌氧发酵24 h后添加所述菌体沉淀。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，好氧发酵48
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72 h后接种活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素浓度为60
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120 g/L。6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素来源为玉米芯或微晶纤维素。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化的棘孢木霉的接种量为发酵培养基体积的1
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5%。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化的丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌的接种量为发酵液体积的1
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10%。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述棘孢木霉活化方式为：取棘孢木霉菌液涂覆于PDA固体培养基中培养72
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120 h，取培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：信丰学，陆家声，姜岷，姜万奎，蒋羽佳，章文明，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：