一种检测细胞色素CYP8B1酶活性的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测细胞色素CYP8B1酶活性的方法，属于生物检测技术领域。本发明专利技术检测细胞色素CYP8B1酶活性时，以式I所示的化合物、或其盐为反应底物，在细胞色素CYP8B1酶作用下反应后，检测单位时间内12α

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞色素CYP8B1酶活性的方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测细胞色素CYP8B1酶活性的方法。

技术介绍

[0002]细胞色素P450(cytochromeP450，简称CYP450)代表着一大类亚铁血红素
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硫醇盐蛋白的超家族，属于单加氧酶的一类，因其在450纳米有特异吸收峰而得名。它们广泛参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。细胞色素P450酶系统可缩写为“CYP”，根据氨基酸序列的同源程度，其成员又依次分为家族、亚家族和亚型酶三级。
[0003]CYP8B1是细胞色素P450酶之一，也称为甾醇12α
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羟化酶，其主要功能是调控两种初级胆汁酸：胆酸(cholic acid，CA)和鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)的合成比例。CA和CDCA化学结构的差别仅在于有或无12α
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羟基，而该化学结构的差异使以CA和CDCA为代表的两类胆汁酸具有不同的生物活性，具体表现在调控胆固醇代谢稳态、促进脂肪及脂质消化吸收、杀灭肠道微生物、调控糖代谢、调控肝肠免疫等方面，由此导致12α
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羟基化胆汁酸的比例对糖脂代谢性疾病及胆结石病的发生发展有重要影响。例如，Murphy等通过CYP8B1敲除小鼠的研究发现CA是肠道胆固醇吸收的重要因素，抑制CYP8B1有望成为治疗高胆固醇血症相关疾病的新策略(Murphy,Parini et al.2005)；Slatis等的研究表明敲除CYP8B1可减少载脂蛋白E敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的形成(Slatis,Gafvels et al.2010)；Patankar等的研究证实CYP8B1敲除小鼠对高胆固醇饮食诱导糖尿病和肝脂肪变性具有抵抗作用(Patankar,Wong et al.2018)；Kaur等的研究发现小鼠CYP8B1敲除可通过促进GLP
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1分泌改善葡萄糖代谢(Kaur,Patankar et al.2015)；Chevre等的研究进一步证实，通过RNA干扰技术抑制CYP8B1表达不仅可以显著降低小鼠经高胆固醇饮食诱导所致的肝脂肪变性，而且可以逆转已形成的肝脏脂肪变性(Chevre,Trigueros
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Motos et al.2018)；Haeusler等通过健康志愿者、肥胖志愿者和2型糖尿病患者的对比研究发现，人体内12α
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羟基化胆汁酸的比例在2型糖尿病自然发病的代谢异常中发挥了重要作用(Haeusler,Astiarraga et al.2013)，肥胖者的胰岛素敏感性降低与12α
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羟基化胆汁酸合成增加高度相关(Haeusler,Camastra et al.2016)，提示CYP8B1是代谢疾病治疗的潜在重要靶点。综上，大量研究表明CYP8B1活性可能与多种代谢性疾病的发生发展有关，因此高效的CYP8B1活性检测方法对于CYP8B1调控相关疗法的开发研究显得至关重要。
[0004]含有CYP8B1酶的生物材料主要包括重组酶、哺乳动物各种器官的亚细胞组分、新鲜分离的肝组织、肝切片、肝细胞等。其中重组酶可来自于细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌建立的克隆表达体系，亚细胞组分主要包括S9成分、细胞浆、微粒体、溶酶体、线粒体及过氧化酶体等。采用这些生物材料，结合相应的辅因子(如NADPH等)和适宜的孵育条件，可通过检测探针反应的底物代谢清除速率或产物生成速率，对上述各种体系中的CYP8B1酶活性进行表征。
[0005]已知CYP8B1可催化若干7α
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羟基化C27甾醇的12α
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羟基化反应，其中对7α
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羟基
‑4‑
胆甾烯
‑3‑
酮(C4)的催化活性较强(Einarsson,1968)。目前文献报道的CYP8B1活性测定方法主要采用C4作为底物，通过检测人肝微粒体中单位时间内C4的12α
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羟基化产物的生成量来表征CYP8B1活性。由于CYP8B1抑制剂可用于预防、治疗或改善与LDL升高相关的心脏代谢疾病，例如动脉粥样硬化、脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎，以及非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)、高血糖和其他与NIDDM相关的症状的治疗，利用C4的12位羟基化反应检测人肝微粒体的CYP8B1活性的方法已应用于CYP8B1抑制剂的筛选研究(WO2014/018375
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A1，WO2018/034917A1)。然而，由于以C4为代表的7α
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羟基化C27甾醇水溶性差，导致检测数据变异较大，需在反应体系中加入Tween
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20、Tween
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80、牛血清白蛋白、甘油等增溶剂(Shaw and Elliott,1979)(Hansson and Wikvall,1982)(Ishida et al.,1992)。迄今为止，人和主要模型动物肝微粒体中CYP8B1酶催化C4的12α
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羟基化反应的动力学数据仍未见详细的数据报道。针对以上述问题，提供一种特异性强、重现性好、操作简便的CYP8B1活性检测方法具有重要意义。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种检测细胞色素CYP8B1酶活性的方法。
[0007]本专利技术提供了式I所示的化合物、或其盐在检测细胞色素CYP8B1酶活性中的用途，其特征在于：检测细胞色素CYP8B1酶活性时，以式I所示的化合物、或其盐为反应底物；
[0008][0009]式I所示的化合物为DHCA消旋体(DHCA)。
[0010]进一步地，所述化合物为如下化合物之一：
[0011][0012]DHCA
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R为R构型DHCA，DHCA
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S为S构型DHCA。
[0013]进一步地，检测细胞色素CYP8B1酶活性时，以前述的化合物、或其盐为反应底物，
在细胞色素CYP8B1酶作用下反应后，检测单位时间内12α
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羟化产物的生成量来测定细胞色素CYP8B1酶活性。
[0014]进一步地，所述12α
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羟化产物为式II所示化合物、或其盐：
[0015][0016]式II所示的化合物为THCA消旋体(THCA)。
[0017]优选地，所述12α
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羟化产物为如下化合物、或其盐：
[0018][0019]THCA
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R为R构型THCA，THCA
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S为S构型THCA。
[0020]本专利技术还提供了前述的化合物、或其盐在制备检测细胞色素CYP8B1酶活性的试剂中的用途，检测细胞色素CYP8B1酶活性时，前述的化合物、或其盐为反应底物。
[0021]进一步地，检测细胞色素CYP8B1酶活性时，以前述的化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.式I所示的化合物、或其盐在检测细胞色素CYP8B1酶活性中的用途，其特征在于：检测细胞色素CYP8B1酶活性时，以式I所示的化合物、或其盐为反应底物；2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述化合物为如下化合物之一：3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：检测细胞色素CYP8B1酶活性时，以权利要求1或2所述的化合物、或其盐为反应底物，在细胞色素CYP8B1酶作用下反应后，检测单位时间内12α
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羟化产物的生成量来测定细胞色素CYP8B1酶活性。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述12α
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羟化产物为式II所示化合物、或其盐：优选地，所述12α
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羟化产物为如下化合物、或其盐：5.权利要求1或2所述的化合物、或其盐在制备检测细胞色素CYP8B1酶活性的试剂中的
用途，其特征在于：检测细胞色素CYP8B1酶活性时，权利要求1或2所述的化合物、或其盐为反应底物。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：检测细胞色素CYP8B1酶活性时，以权利要求1或2所述的化合物、或其盐为反应底物，在细胞色素CYP8B1酶作用下反应后，检测单位时间内1...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰轲，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：