不同浓度水平细胞因子多重检测诊断工具、方法及应用技术

本发明专利技术提出一种用于不同浓度水平细胞因子多重检测的一体化诊断工具，方法及应用，所述一体化诊断工具包括三种具有高催化活性的纳米探针，分别为Pt

【技术实现步骤摘要】
不同浓度水平细胞因子多重检测诊断工具、方法及应用


[0001]本专利技术属于生物化学分析领域，涉及一种基于DNA调控纳米催化剂价态及组装建立检测范围可调的多重细胞因子可视化检测方法，具体涉及一种不同浓度水平细胞因子多重检测诊断工具，应用一体化诊断工具构建免疫检测体系的方法构建方法，以及应用一体化诊断工具在体外检测血液中不同浓度细胞因子的用途。

技术介绍

[0002]细胞因子介导的有益和破坏性炎症在生命活动中保持一种微妙的平衡是非常重要的，并在空间、时间和数量上都被严格调控。如果不能解决初始的炎症，细胞因子环境和大量的促炎症反应将导致慢性炎症的建立，从而驱动疾病进展。事实上，越来越多的证据表明细胞因子网络反映了疾病特定阶段的一个特征，包括癌症、动脉粥样硬化和炎症性肠病。而且，目前的临床进展和实验结果支持细胞因子靶向治疗癌症。如今，细胞因子的同时和多重检测在生物医学诊断中具有广泛的应用场景。例如，细胞因子的检测可用于早期感染的辅助诊断、及时指导治疗和疗效评估。此外，对细胞因子网络中不同但具有临床相关性的细胞因子进行分析，对于实现个性化医疗的潜力具有重要意义。
[0003]然而，目前细胞因子检测仍面临着挑战，定量真实样品中不同浓度的细胞因子(从pg/mL到
µ
g/mL)是其中主要的挑战。比如，人血液中C
‑
反应蛋白（C
‑
reactive protein，CRP）一般在
µ
g/mL水平，而白介素
‑
6（interleukin<br/>‑
6，IL
‑
6）和原降钙素（procalcitonin，PCT）则处于非常低的水平（一般在pg/mL到ng/mL水平）。检测这些浓度相差非常大的细胞因子不仅需要检测方法具有非常宽的检测范围，同时还需要具有高灵敏度，这些要求目前仍未被满足。更糟糕的是，细胞因子的快速检测取决于医院实验室检测的质量，但许多医院只能使用不同类型的检测试剂盒来检测多种细胞因子，导致检测准确性受到了质疑。根本原因在于，金标准技术ELISA检测细胞因子时使用的抗体有潜在的重大局限性。即，抗体的单位点结合特性只能产生双剂量/响应曲线，检测范围固定，跨度仅为2个数量级。这种固定的检测范围限制了这些抗体在测量多个数量级的各种目标时的应用，包括细胞因子（从pg/mL到
µ
g/mL）和临床相关HIV载量（一般超过5个数量级）。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，课题组研发发现，表面工程设计促进了各种优异的纳米粒子在生物医学诊断中的广泛应用，在此基础上课题组进行了大胆的设想，设想通过对纳米催化剂进行表面工程设计也许能解决传统ELISA在分子识别、信号放大、检测范围等方面的局限性。同时，课题组考虑到一种一体化的诊断工具或试剂盒可以通过提供多种临床相关细胞因子的综合信息来进一步指导治疗，在此设想下，课题组采用纳米粒子表面工程策略设计并制造了一种一体化的诊断工具，经实验，该诊断工具能够通过DNA调控纳米催化剂价态和编码纳米催化剂组装，动态调控并拓宽检测范围，同时具有了保证多重检测能力和高灵敏度的优势，能用于不同浓度水平细胞因子的多重检测。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提出一种用于不同浓度水平细胞因子多重检测的一体化诊断工具：包括三种具有高催化活性的纳米探针，分别为Pt
‑
1，Pt
‑
2和Pt
‑
3；进一步的，通过铂包金纳米颗粒（platinum
‑
coated gold nanoparticles, Pt@AuNPs）表面功能化修饰，制备三种具有高催化活性的纳米探针；具体的，Pt
‑
1通过将靶标细胞因子的检测抗体连接到Pt@AuNPs表面制备而成；Pt
‑
2由将单链ssDNA1和靶标细胞因子检测抗体同时固定到Pt@AuNPs表面制备而成；Pt
‑
3为将单链ssDNA2连接到Pt@AuNPs表面制备而成；进一步的，所述诊断工具通过DNA调控Pt@AuNPs表面检测抗体数量和DNA编码Pt@AuNPs组装完成不同水平细胞因子的检测。
[0006]进一步的，所述诊断工具通过浓缩识别分子到单个纳米催化剂以提高靶标识别能力和通过纳米催化剂可控组装完成信号放大。
[0007]进一步的，所述Pt
‑
1的制备方法包括如下步骤：S11，将10
ꢀµ
L 1 mg/mL生物素biotin标记的检测抗体与500
ꢀµ
L 0.5 ng/mL链霉亲和素streptavidin，SA包被的SA
‑
Pt@AuNPs室温孵育1 h， 通过biotin
‑
SA高亲和力作用使检测抗体连接到A
‑
Pt@AuNPs表面，得到靶标细胞因子的检测抗体连接到Pt@AuNPs表面的连接产物；S12，靶标细胞因子的检测抗体连接到Pt@AuNPs表面的连接产物使用1% BSA对非特异结合位点进行封闭30 min；S13，使用PBST1.76 mM KH2PO4， 8.1 mM Na2HPO4， 136.89 mM NaCl， 2.67 mM KCl， 0.5% Tween
‑
20缓冲液清洗三次，通过低速离心进行纯化；纯化好的检测抗体
‑
SA
‑
Pt@AuNPs连接产物即为Pt
‑
1。
[0008]进一步的，所述Pt
‑
2的制备方法包括如下步骤：S21，将10
ꢀµ
L 1 mg/mL biotin标记的检测抗体与10
ꢀµ
L 5
ꢀµ
M biotin标记ssDNA1共同与500
ꢀµ
L 0.5 ng/mL SA
‑
Pt@AuNPs室温孵育1 h， 通过biotin
‑
SA高亲和力作用使检测抗体与ssDNA1连接到SA
‑
Pt@AuNPs表面，得到将单链ssDNA1和靶标细胞因子检测抗体同时固定到Pt@AuNPs表面的连接产物；S22，单链ssDNA1和靶标细胞因子检测抗体同时固定到Pt@AuNPs表面的连接产物使用1% BSA对非特异结合位点进行封闭30 min；S23，使用PBST清洗三次，通过低速离心进行纯化，纯化好的连接产物即为Pt
‑
2。
[0009]进一步的，所述Pt
‑
3的制备方法包括如下步骤：S31，将10
ꢀµ
L 1 mg/mL biotin标记的ssDNA2与500
ꢀµ
L 0.5 ng/mL SA
‑
Pt@AuNPs室温孵育1 h， 通过biotin
‑
SA高亲和力作用使ssDNA2连接到SA
‑
Pt@AuNPs表面，得到单链s本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于不同浓度水平细胞因子多重检测的一体化诊断工具，其特征在于: 包括三种具有高催化活性的纳米探针，分别为Pt
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1，Pt
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2和Pt
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3；所述Pt
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1通过将靶标细胞因子的检测抗体连接到Pt@AuNPs表面制备而成；所述Pt
‑
2由将单链ssDNA1和靶标细胞因子检测抗体同时固定到Pt@AuNPs表面制备而成；所述Pt
‑
3为将单链ssDNA2连接到Pt@AuNPs表面制备而成。2.根据权利要求1所述的用于不同浓度水平细胞因子多重检测的一体化诊断工具其特征在于：所述诊断工具通过DNA调控Pt@AuNPs表面检测抗体数量和DNA编码Pt@AuNPs组装完成不同水平细胞因子的检测。3.根据权利要求2所述的用于不同浓度水平细胞因子多重检测的一体化诊断工具其特征在于：所述诊断工具通过浓缩识别分子到单个纳米催化剂以提高靶标识别能力和通过纳米催化剂可控组装完成信号放大。4.根据权利要求1所述的用于不同浓度水平细胞因子多重检测的一体化诊断工具其特征在于所述Pt
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1的制备方法包括如下步骤：S11，将10
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L 1 mg/mL生物素biotin标记的检测抗体与500
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L 0.5 ng/mL链霉亲和素streptavidin，SA包被的SA
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Pt@AuNPs室温孵育1 h， 通过biotin
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SA高亲和力作用使检测抗体连接到A
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Pt@AuNPs表面，得到靶标细胞因子的检测抗体连接到Pt@AuNPs表面的连接产物；S12，靶标细胞因子的检测抗体连接到Pt@AuNPs表面的连接产物使用1% BSA对非特异结合位点进行封闭30 min；S13，使用PBST1.76 mM KH2PO4， 8.1 mM Na2HPO4， 136.89 mM NaCl， 2.67 mM KCl， 0.5% Tween
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20缓冲液清洗三次，通过低速离心进行纯化；纯化好的检测抗体
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SA
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Pt@AuNPs连接产物即为Pt
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1。5.根据权利要求1所述的用于不同浓度水平细胞因子多重检测的一体化诊断工具其特征在于所述Pt
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2的制备方法包括如下步骤：S21，将10
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L 1 mg/mL biotin标记的检测抗体与10
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L 5
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M biotin标记ssDNA1共同与500
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L 0.5 ng/mL SA
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Pt@AuNPs室温孵育1 h， 通过biotin
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SA高亲和力作用使检测抗体与ssDNA1连接到SA
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Pt@AuNPs表面，得到将单链ssDNA1和靶标细胞因子检测抗体同时固定到Pt@AuNPs表面的连接产物；S22，单链ssDNA1和靶标细胞因子检测抗体同时固定到Pt@AuNPs表面的连接产物使用1% BSA对非特异结合位点进行封闭30 min；S23，使用PBST清洗三次，通过低速离心进行纯化，纯化好的连接产物即为Pt
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2。6.根据权利要求1所述的用于不同浓度水平细胞因子多重检测的一体化诊断工具其特征在于所述Pt
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3的制备方法包括如下步骤：S31，将10
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L 1 mg/mL biotin标记的ssDNA2与500
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L 0.5 ng/mL SA
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Pt@AuNPs室温孵育1 h， 通过biotin
‑
SA高亲和力作用使ssDNA2连接到SA
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Pt@AuNPs表面，得到单链ssDNA2连接到Pt@AuNPs表面的连接产物；S32，单链ssDNA2...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷咏梅，李根喜，石海，曾天宇，
申请(专利权)人：江苏省人民医院南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：