多种外泌体蛋白的同步检测方法技术

本发明专利技术提供了一种多种外泌体蛋白的同步检测方法，包括步骤：形成免疫磁珠MBs2@Ab1、形成多种Ab2

【技术实现步骤摘要】
多种外泌体蛋白的同步检测方法


[0001]本专利技术属于外泌体检测
，具体涉及一种多种外泌体蛋白的同步检测方法。

技术介绍

[0002]外泌体是活细胞主动分泌到体液中粒径为30～150nm的细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)，其不仅体液含量高(可达1
×
10
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particles/mL)、来源广、稳定性好、时效性强，还具有细胞来源特异性，或为理想的肿瘤标志物。研究表明外泌体蛋白广泛参与了上皮间质转化、诱导血管生成，促进转移前微环境形成、以及免疫逃逸等过程，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。目前已报道的外泌体中肺癌蛋白标志物有细胞外基质蛋白1、程序性细胞死亡配体1、脂多糖结合蛋白、MUC1粘蛋白、富亮氨酸α2糖蛋白1、表皮生长因子受体和上皮细胞粘附分子等。然而，目前尚未发现一种能明确诊断肺癌的特异性蛋白标志物，对外泌体中多种蛋白标志进行联合检测是提高肺癌筛查准确性的有效方法。
[0003]目前常用的外泌体蛋白的检测方法有酶联免疫吸附试验、免疫印迹和液相色谱
‑
质谱法等。其中酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)虽然可以检测单一外泌体蛋白，但是较低浓度的蛋白则难以检测到，而且还不适用于多种蛋白的同步检测。免疫印迹耗时长，无法对蛋白含量进行准确定量、且检测结果受到可溶性蛋白的干扰。液相色谱
‑
质谱法需要昂贵的仪器，操作相对复杂，需要有专业的技术人员，难以在临床上应用。因此，目前亟需开发利于临床上使用的同步测定多种目标物的外泌体分析方法。

技术实现思路

[0004]鉴于此，本专利技术有必要提供一种灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单且有利于临床上实现同步测定多种外泌体蛋白的方法，以解决上述问题。
[0005]为此，本专利技术提供一种多种外泌体蛋白的同步检测方法，包括步骤：
[0006]形成免疫磁珠：将多种待测外泌体蛋白的捕获抗体Ab1同时偶联到羧基磁珠MBs2上形成免疫磁珠MBs2@Ab1；
[0007]形成多种Ab2
‑
W：将所述多种待测外泌体蛋白中的每一种外泌体蛋白对应的检测抗体Ab2生物素化，形成生物素化检测抗体Ab2
‑
Bio；将每一种生物素化检测抗体Ab2
‑
Bio与对应的脱氧核酶W偶联形成偶联物Ab2
‑
W；
[0008]形成链霉亲和素磁珠Track：将链霉亲和素磁珠MBs3与所述多种待测外泌体蛋白中的每一种外泌体蛋白的生物素化底物链T进行偶联，形成修饰有多种所述生物素化底物链T的MBs3 Track，将该MBs3 Track重悬于剪切反应液中形成MBs3 Track悬浮液，其中，所述剪切反应液中包括辅酶因子和RNase抑制剂；
[0009]形成双抗夹心复合物：将所述免疫磁珠MBs2@Ab1、含有所述多种待测外泌体蛋白的待测样品以及多种偶联物Ab2
‑
W混合孵育，形成双抗夹心复合物；
[0010]形成多种核酸短链P：将所述MBs3 Track悬浮液加入所述双抗夹心复合物中进行再次孵育，使每一脱氧核酶W切割对应的生物素化底物链T产生核酸短链P，磁分离，收集含有多种核酸短链P的上清液；
[0011]形成待测荧光液：先将所述含有多种核酸短链P的上清液与信号溶液混合孵育，其中，所述信号溶液中包括每一核酸短链P对应的Cas蛋白、Cas
‑
crRNA和荧光信号探针，使每一核酸短链P与其对应的Cas
‑
crRNA杂交，激活对应的Cas蛋白以切割对应的荧光信号探针使其荧光基团恢复荧光，形成待测荧光液；
[0012]荧光检测：采用多功能微孔板读板机同步检测所述待测荧光液中的每一荧光基团的荧光强度，利用每一荧光基团的荧光强度与对应的待测外泌体蛋白的浓度之间的关系构建对应的回归方程。
[0013]基于上述，所述形成免疫磁珠的步骤包括：利用EDC/Sulfo
‑
NHS法将SAA1的捕获抗体Ab1
SAA1
和FV的捕获抗体Ab1
FV
同时偶联到羧基磁珠MBs2上，并采用牛血清蛋白溶液封闭处理，得到所述免疫磁珠MBs2@Ab1，将所述疫磁珠MBs2@Ab1重悬于磷酸盐缓冲溶液中，形成免疫磁珠MBs2@Ab1悬浮液。
[0014]其中，本文中的“SAA1”是指血清淀粉样蛋白A，英文全称Serum amyloid A
‑
1protein；“FV”是指凝血因子V，英文全称Coagulation factor V。
[0015]基于上述，所述形成多种Ab2
‑
W的步骤包括：
[0016]将SAA1的检测抗体Ab2
SAA1
溶液和Sulfo
‑
NHS
‑
LC
‑
Biotin均匀混合，并于室温振荡反应，获得SAA1的生物素化检测抗体Ab2
SAA1
‑
Bio溶液；先将所述生物素化检测抗体Ab2
SAA1
‑
Bio溶液与链霉亲和素溶液于室温下反应，再加入脱氧核酶W1溶液并于室温反应，制得偶联物Ab2
SAA1
‑
W1溶液；
[0017]将FV的检测抗体Ab2
FV
溶液和Sulfo
‑
NHS
‑
LC
‑
Biotin均匀混合，并于室温振荡反应，获得FV的生物素化检测抗体Ab2
FV
‑
Bio溶液；先将所述生物素化检测抗体Ab2
FV
‑
Bio溶液与链霉亲和素溶液于室温下反应，再加入脱氧核酶W2溶液并于室温反应，制得偶联物Ab2
FV
‑
W2溶液。
[0018]基于上述，所述SAA1的捕获抗体Ab1
SAA1
为鼠抗人SAA1单克隆捕获抗体，所述FV的捕获抗体Ab1
FV
为兔抗人FV单克隆捕获抗体，所述SAA1的检测抗体Ab2
SAA1
为鼠抗人SAA1单克隆检测抗体，所述FV的检测抗体Ab2
FV
为绵羊抗人FV多克隆检测抗体。
[0019]基于上述，所述形成链霉亲和素磁珠Track的步骤包括：将底物链T1和T2的混合液与所述链霉亲和素磁珠MBs3在室温中震荡反应，使所述底物链T1和T2同时修饰在所述链霉亲和素磁珠MBs3上，磁分离，获得所述链霉亲和素磁珠MBs3 Track；将所述链霉亲和素磁珠Track重悬于所述剪切反应液中，形成MBs3 Track悬浮液；其中，所述剪切反应液的pH为7.0～8.0，且包括10～90mmol/L MgCl2、0.6～1.2mmol/LDTT和0.8～1.6U/μL RNase抑制剂。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多种外泌体蛋白的同步检测方法，包括步骤：形成免疫磁珠：将多种待测外泌体蛋白的捕获抗体Ab1同时偶联到羧基磁珠MBs2上形成免疫磁珠MBs2@Ab1；形成多种Ab2
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W：将所述多种待测外泌体蛋白中的每一种外泌体蛋白对应的检测抗体Ab2生物素化，形成生物素化检测抗体Ab2
‑
Bio；将每一种生物素化检测抗体Ab2
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Bio与对应的脱氧核酶W偶联形成偶联物Ab2
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W；形成链霉亲和素磁珠Track：将链霉亲和素磁珠MBs3与所述多种待测外泌体蛋白中的每一种外泌体蛋白的生物素化底物链T进行偶联，形成修饰有多种所述生物素化底物链T的MBs3 Track，将该MBs3 Track重悬于剪切反应液中形成MBs3 Track悬浮液，其中，所述剪切反应液中包括辅酶因子和RNase抑制剂；形成双抗夹心复合物：将所述免疫磁珠MBs2@Ab1、含有所述多种待测外泌体蛋白的待测样品以及多种偶联物Ab2
‑
W混合孵育，形成双抗夹心复合物；形成多种核酸短链P：将所述MBs3 Track悬浮液加入所述双抗夹心复合物中进行再次孵育，使每一脱氧核酶W切割对应的生物素化底物链T产生核酸短链P，磁分离，收集含有多种核酸短链P的上清液；形成待测荧光液：先将所述含有多种核酸短链P的上清液与信号溶液混合孵育，其中，所述信号溶液中包括每一核酸短链P对应的Cas蛋白、Cas
‑
crRNA和荧光信号探针，使每一核酸短链P与其对应的Cas
‑
crRNA杂交，激活对应的Cas蛋白以切割对应的荧光信号探针使其荧光基团恢复荧光，形成待测荧光液；荧光检测：采用多功能微孔板读板机同步检测所述待测荧光液中的每一荧光基团的荧光强度，利用每一荧光基团的荧光强度与对应的待测外泌体蛋白的浓度之间的关系构建对应的回归方程。2.根据权利要求1所述的同步检测方法，其特征在于，所述形成免疫磁珠的步骤包括：利用EDC/Sulfo
‑
NHS法将SAA1的捕获抗体Ab1
SAA1
和FV的捕获抗体Ab1
FV
同时偶联到羧基磁珠MBs2上，并采用牛血清蛋白溶液封闭处理，得到所述免疫磁珠MBs2@Ab1，将所述疫磁珠MBs2@Ab1重悬于磷酸盐缓冲溶液中，形成免疫磁珠MBs2@Ab1悬浮液。3.根据权利要求2所述的同步检测方法，其特征在于，所述形成多种Ab2
‑
W的步骤包括：将SAA1的检测抗体Ab2
SAA1
溶液和Sulfo
‑
NHS
‑
LC
‑
Biotin均匀混合，并于室温振荡反应，获得SAA1的生物素化检测抗体Ab2
SAA1
‑
Bio溶液；先将所述生物素化检测抗体Ab2
SAA1
‑
Bio溶液与链霉亲和素溶液于室温下反应，再加入脱氧核酶W1溶液并于室温反应，制得偶联物Ab2
SAA1
‑
W1溶液；将FV的检测抗体Ab2
FV
溶液和Sulfo
‑
NHS
‑
LC
‑
Biotin均匀混合，并于室温振荡反应，获得FV的生物素化检测抗体Ab2
FV
‑
Bio溶液；先将所述生物素化检测抗体Ab2
FV
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Bio溶液与链霉亲和素溶液于室温下反应，再加入脱氧核酶W2溶液并于室温反应，制得偶联物Ab2
FV
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W2溶液。4.根据权利要求3所述的同步检测方法，其特征在于，所述SAA1的捕获抗体Ab1
SAA1
为鼠抗人SAA1单克隆捕获抗体，所述FV的捕获抗体Ab1
FV
为兔抗人FV单克隆捕获抗体，所述SAA1的检测抗体Ab2
SAA1
为鼠抗人SAA1单克隆检测抗体，所述FV的检测抗体Ab2
FV
为绵羊抗人FV多克隆检测抗体。
5. 根据权利要求3或4所述的同步检测方法，其特征在于，所述形成链霉亲和素磁珠Track的步骤包括：将底物链T1和T2的混合液与所述链霉亲和素磁珠MBs...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴拥军，丁丽华，屈凌波，何磊良，玉崧成，于斐，王艺琳，菅宁歌，杨瑞英，王佳，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：