一种羧酸标记HPLC-UV定量检测鼠李糖脂的方法技术

本发明专利技术涉及一种羧酸标记HPLC

【技术实现步骤摘要】
一种羧酸标记HPLC
‑
UV定量检测鼠李糖脂的方法


[0001]本专利技术属于糖脂检测
，涉及一种羧酸标记HPLC
‑
UV定量检测鼠李糖脂的方法。

技术介绍

[0002]鼠李糖脂是微生物糖脂中最具有代表性的一类生物表面活性剂，具有显著降低表/界面张力、低毒性、可生物降解、环境友好等特性。它们可以将水的表面张力降低至30mN/m以下，并将十六烷
‑
水的界面张力降低至<1mN/m，临界胶束浓度(CMC)为5
‑
200mg/L。从结构上讲，鼠李糖脂属于阴离子生物表面活性剂，每个同源物由1或2个鼠李糖残基和1或2个长度为8
‑
12个碳的脂肪酸组成，最多有一个不饱和键，在发酵液中发现了110多种不同类型的鼠李糖脂。鼠李糖脂在清洁油罐和在石油工业中提高石油采收率(EOR)方面的出色潜力已经得到确证。鼠李糖脂在环境修复方面也得到应用，它可以从土壤和水中去除油、杀虫剂和重金属。此外，由于鼠李糖脂具有很强的发泡性和润湿性。因此，被广泛用于个人护理领域，即洗涤剂和清洁剂。
[0003]目前，已有一些关于鼠李糖脂定量的研究，文献报道的鼠李糖脂定量方法有酸沉法、蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、临界胶束浓度法、油扩散法、HPLC
‑
ELSD法、 HPLC
‑
MS/MS法等。其中酸沉法、蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、临界胶束浓度法、油扩散法测定的鼠李糖脂浓度偏差较大，准确度不高。HPLC
‑
>ELSD能够直接检测鼠李糖脂，然而，由于缺乏鼠李糖脂标准进行比较，培养基中存在的每个鼠李糖脂衍生物的结构难以确定。虽然HPLC
‑
MS/MS是目前检测鼠李糖脂最灵敏的方法，但HPLC
‑
MS/MS方法存在的问题是标准物制备困难，仪器成本较高以及运行和维护费用高等问题。因此，建立一种高灵敏度，操作简单的鼠李糖脂定量方法很有必要。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的就是提供一种羧酸标记HPLC
‑
UV定量检测鼠李糖脂的方法，用于解决高效液相色谱检测鼠李糖脂含量时紫外吸收波长短干扰严重、紫外吸收弱、灵敏度低、无单一标准物质的问题。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0006]一种羧酸标记HPLC
‑
UV定量检测鼠李糖脂的方法，包括以下步骤：
[0007]1)将待测溶液pH调节至酸性，并低温静置，得到酸沉后的待测溶液；
[0008]2)采用有机溶剂进行萃取，取有机相，再去除有机溶剂，并配制成溶液，得到萃取物溶液；
[0009]3)将萃取物溶液与对硝基苯乙二胺、TBTU(O
‑
苯并三氮唑
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲四氟硼酸)、三乙胺、乙腈混合，并进行衍生化反应，得到衍生化产物混合液；
[0010]4)采用HPLC
‑
UV对衍生化产物混合液进行检测，由于目前缺乏鼠李糖脂标准品，因此以脂肪酸为外标物，根据外标物标准曲线计算得到待测溶液中鼠李糖脂的浓度。
[0011]进一步地，步骤1)中，pH调节终点为1.5
‑
2.5，静置温度为3
‑
5℃，静置时间为10
‑
16h。
[0012]进一步地，所用调节溶液为盐酸，浓度为4
‑
8mol/L。
[0013]进一步地，步骤2)中，所用有机溶剂为乙酸乙酯；去除有机溶剂的方法为：将有机相在55
‑
60℃下旋蒸。
[0014]进一步地，步骤3)中，所述的萃取物溶液的浓度为0.1mg/L～2g/L，或者将萃取物稀释1
‑
2倍；
[0015]所述的萃取物溶液、对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈的用量比为0.5 mL:(5
‑
20)mg:(5
‑
20)mg:0.5mL:(1.5
‑
2.0)mL。
[0016]进一步地，所述的衍生化反应中，反应温度为30
‑
75℃，反应时间为15
‑
180min。
[0017]进一步地，步骤4)中，所述的外标物包括壬酸，所述的外标物标准曲线的绘制方法包括以下步骤：
[0018]M1：将不同量的壬酸，与对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈混合，并进行衍生化反应，得到不同壬酸浓度的外标样品溶液；
[0019]M2：采用HPLC
‑
UV对不同壬酸浓度的外标样品溶液进行检测，以壬酸浓度为横坐标，以壬酸相应出峰时间(次色谱条件下为8.0
‑
8.5min)的峰面积为纵坐标作图，即得到外标物标准曲线。
[0020]进一步地，步骤M1中，所述的对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈的用量比为(5
‑
20)mg:(5
‑
20)mg:0.5mL:1.5mL；
[0021]所述的外标样品溶液中，壬酸浓度为0
‑5×
10
‑4mol/L。
[0022]进一步地，步骤4)中，根据外标物标准曲线计算得到待测溶液中鼠李糖脂的浓度，具体为：对于鼠李糖脂，因为标记后每个分子含有一个吸收基团，其摩尔吸收系数与普通脂肪酸相同，单位摩尔浓度在HPLC上具有相同的响应。将得到的各种鼠李糖脂峰面积代入壬酸标准曲线计算出相应的摩尔浓度，通过乘以相对应的鼠李糖脂相对分子质量求出其质量浓度。
[0023]进一步地，步骤4)中，HPLC
‑
UV检测中，紫外检测波长为386nm。
[0024][0025]与现有技术相比，本专利技术具有以下特点：
[0026]1)本专利技术提供了一种基于衍生化反应的鼠李糖脂外标检测法，以壬酸作为外标物质，通过衍生化解决了高效液相色谱法直接测定鼠李糖脂原始样品吸收波长短 (小于210nm)干扰严重，吸收弱灵敏度低、达不到检测限的问题；
[0027]2)本专利技术中的衍生化反应在70℃下经过60min即可完成，具有反应快速完全，检测效率高等优点；
[0028]3)本专利技术使用紫外检测器对衍生化产物进行检测，最大吸收波长达到386nm，属于较高波长段，不易被溶剂或相关杂质影响，抗干扰性强；
[0029]4)鼠李糖脂RhaC10C10和RhaRhaC10C10的检出限分别达到0.018mg/L和0.014mg/L，相较于检出限为50mg/L的直接测量表面张力、检出限为20mg/L的蒽酮硫酸法、检出限为10mg/L的C
13
标记，LC
‑
MS检测、0.7mg/L的HPLC
‑
CAD 直接检测等方法，灵敏度明显提高；
[0030]5)本专利技术对衍生化方法进行重复性和稳定性检测，5次重复实验中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羧酸标记HPLC
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UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)将待测溶液pH调节至酸性，并低温静置，得到酸沉后的待测溶液；2)采用有机溶剂进行萃取，取有机相，再去除有机溶剂，并配制成溶液，得到萃取物溶液；3)将萃取物溶液与对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈混合，并进行衍生化反应，得到衍生化产物混合液；4)采用HPLC
‑
UV对衍生化产物混合液进行检测，以脂肪酸为外标物，根据外标物标准曲线计算得到待测溶液中鼠李糖脂的浓度。2.根据权利要求1所述的一种羧酸标记HPLC
‑
UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤1)中，pH调节终点为1.5
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2.5，静置温度为3
‑
5℃，静置时间为10
‑
16h。3.根据权利要求2所述的一种羧酸标记HPLC
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UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，所用调节溶液为盐酸，浓度为4
‑
8mol/L。4.根据权利要求1所述的一种羧酸标记HPLC
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UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤2)中，所用有机溶剂为乙酸乙酯；去除有机溶剂的方法为：将有机相在55
‑
60℃下旋蒸。5.根据权利要求1所述的一种羧酸标记HPLC
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UV定量检测鼠李糖脂的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的萃取物溶液、对硝基苯乙二胺、TBTU、三乙胺、乙腈的用量比为0.5mL:(5
‑
20)mg:(5
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20)mg:0.5mL:(1.5
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2.0)mL。6.根据权利要求5所述的一种羧酸标记HPLC
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【专利技术属性】
技术研发人员：牟伯中，刘金峰，杨世忠，周静，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：