一种胸腺类器官微球及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种胸腺类器官微球及其制备方法与应用，向加有透明质酸钠凝胶的Transwell小室内接种胸腺混合细胞，放入DMEM/F12

【技术实现步骤摘要】
一种胸腺类器官微球及其制备方法与应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种胸腺类器官微球及其制备方法与应用。
(二)
技术介绍

[0002]现阶段人工胸腺类器官的构建方式未能形成稳定的体系，研究者使用的方法各异，主要分为支架型和非支架型。支架型胸腺类器官主要以脱细胞胸腺骨架、生物相容性骨架材料等为支架，而非支架型胸腺类器官的构建主要依靠特定的培养基或特殊培养方式使胸腺相关细胞以三维形式发育增殖，这些形成的胸腺类器官功能及结构稳定性差异较大，重现性较低。而其中涉及的基因修饰等方式所需的技术水平较高，且成本费用高昂，难以做到短期内大批量制备，其规模和费用都限制了T细胞及类胸腺组织的产量。
[0003]但由于水凝胶内细胞密度的增加以及自身厚度等原因，影响了细胞养分及氧气的供给，三维培养21天后导致凝胶内的细胞开始大量死亡。而且，目前关于胸腺类器官的保存并无明确的方法。常规采用体外冻存等方法保存类器官，但是细胞冻存和复苏分别涉及到细胞内外液体结晶和细胞内外晶体化为液体的过程，会不可避免地造成细胞损伤，鉴于类器官的多细胞构成，这种损伤更甚，因此会使得冻存复苏后的活性无法估计。本专利技术采用透明质酸酶37℃消化胸腺类器官，依然保持胸腺类器官的特征性三维结构。通过添加免疫球蛋白可增加对胸腺类器官细胞的保护作用，同时，采用微流控技术分装胸腺类器官三维细胞团，可以保证类器官在4℃下维持最长时间的活性，其类器官的生长活性和形态不受影响。
[0004]诱发脱发的因素多种多样，目前尚无一种公认的细胞源可以作为毛囊再生的种子细胞，组织工程也还未实现毛囊再生。药物、物理治疗依然是脱发治疗的重要手段，但其单一疗法的效果不理想。本专利技术在体外通过3D胸腺类器官微球制备，使毛囊再生的生物工程策略成为可能。在这些系统中，基于胸腺细胞和胸腺上皮细胞的器官胚芽被创造出来，移植到裸鼠体内后对于促进裸鼠毛囊修复以及促进毛发再生中的至少一者具有显著的效果，有助于改善毛发生长状态。
[0005]本专利技术属于支架型胸腺类器官，操作简单、结构稳定、制作成本低。其中使用的永生化小鼠胸腺上皮细胞株(iTECs)，保持了TECs细胞独特的分子性质，而生物相容性骨架材料为交联透明质酸钠。该材料在透光性和易操作性上占有很大优势，具有良好生物相容性，适合大规模的胸腺类器官的三维立体培养。
(三)
技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供一种胸腺类器官微球及其制备方法与在制备毛发生长促进剂中的应用，所述胸腺类器官微球能在体外模拟胸腺微环境，具有诱导、维持T细胞定型和分化的能力，并在体内模拟正常小鼠胸腺生成，改善免疫缺陷。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：
[0008]本专利技术提供一种胸腺类器官微球，所述胸腺类器官微球按如下方法制备：(1) 将
透明质酸钠水凝胶加入Transwell小室中，加热至室温或放入37℃培养箱复温半小时使其软化覆盖小室底膜，再将Transwell小室放入加有DMEM/F12
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B27培养基的培养孔板中；(2)向步骤(1)Transwell小室内接种胸腺混合细胞，37℃、5％CO2培养5
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10天；所述胸腺混合细胞是由敲低/过表达Tβ15b1基因的永生化胸腺上皮细胞与新鲜离体的敲低/过表达Tβ15b1基因的原代胸腺细胞混合而成；(3)在步骤(2)的 Transwell小室中加入透明质酸酶水溶液，37℃静置培养酶解凝胶释放胸腺混合细胞 (优选培养16h)，离心，收集沉淀并用含1μg/mL免疫球蛋白的PBS重悬，加入海藻酸钠，混匀，获得混合液；(4)将步骤(3)混合液滴入氯化钙水溶液中，获得所述的胸腺类器官微球。
[0009]优选的，步骤(1)Transwell小室底部为带孔的透明聚酯(PE)膜，所述透明聚酯膜的孔径为5
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10μm，优选8μm。
[0010]优选的，步骤(1)所述胸腺混合细胞是由永生化胸腺上皮细胞与新鲜离体的原代胸腺细胞以细胞数量比10
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50:1混合而成，优选20:1。所述永生化胸腺上皮细胞 (iTECs)参照文献(Shen JM,Ma L,He K,et al.Identification and functional study ofimmortalized mouse thymic epithelial cells.Biochem Biophys Res Commun. 2020；525(2):440
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446.)制备获得。所述永生化胸腺上皮细胞与新鲜离体的原代胸腺细胞敲低/过表达Tβ15b1基因的方法采用本领域通用病毒转染方法既可，优选采用 Tβ15b1 OX病毒液或者Tβ15b1 shRNA病毒液通过瞬时转染构建。
[0011]优选的，步骤(1)所述敲低Tβ15b1基因的方法为：将永生化胸腺上皮细胞用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，37℃培养48h至对数生长期，弃原培养液，PBS润洗一次，加入胰酶
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EDTA消化液(0.25％胰酶+0.02％ EDTA，含酚红)消化1min后，加入DMEM完全培养基终止消化，800rpm离心5min，收集细胞，用10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种于24孔板(优选2.0
×
104个/孔)，37℃、5％CO2培养箱培养24h，弃去培养液；加入Tβ15b1 shRNA慢病毒 (购自山东维真生物科技有限公司，基因序列号：NM_001081983.1，滴度为3.4
×
10
8 PFU/mL)、含10％FBS的DMEM完全培养基和溴化己二甲铵(polybrene)以促进感染，轻吹混匀，在37℃、5％CO2培养箱中病毒感染24h后，用新鲜的含体积浓度 10％FBS的DMEM完全培养基替换含有病毒的培养基，继续培养72h后，换用含5 μg/mL嘌呤霉素和10％FBS的DMEM完全培养基，每1
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2d换新鲜的含有5μg/mL 嘌呤霉素和10％FBS的DMEM培养基，以替换含大量死细胞的培养基，直至感染病毒的组再无细胞出现死亡，剩下的细胞即为敲低Tβ15b1基因的稳定细胞株iTECs；所述Tβ15b1 shRNA慢病毒、含10％FBS的DMEM完全培养基和polybrene体积比为15:485:2。所述胸腺细胞敲低Tβ15b1基因的方法同永生化胸腺上皮细胞，不同之处在于将含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基改成含体积浓度10％FBS的 DMEM/F12
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B27培养基。
[0012]优选的，步骤(1)所述过表达Tβ15b1基因的方法为：将永生化胸腺上皮细胞 (iTECs)用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种至24孔板，37℃培养1天至对数生长期，弃去原培养液；按重复感染度(MOI)(MOI＝100)，向24 孔板中加入Tβ15b1 OX病毒液(购自山东维真生物科技有限公司，基因序列号： NM_001081983.1，滴本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胸腺类器官微球，其特征在于，所述胸腺类器官微球按如下方法制备：(1)将透明质酸钠凝胶加入Transwell小室中，加热至室温或放入37℃培养箱复温半小时使其软化覆盖小室底膜，再将Transwell小室放入加有DMEM/F12
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B27培养基的培养孔板中；(2)向步骤(1)Transwell小室内接种胸腺混合细胞，37℃、5％CO2培养5
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10天；所述胸腺混合细胞是由敲低/过表达Tβ15b1基因的永生化胸腺上皮细胞与新鲜离体的敲低/过表达Tβ15b1基因的原代胸腺细胞混合而成；(3)在步骤(2)的Transwell小室中加入透明质酸酶水溶液，37℃静置培养16h，离心，收集沉淀并用含1μg/mL免疫球蛋白的PBS重悬，加入海藻酸钠，混匀，获得混合液；(4)将步骤(3)混合液滴入氯化钙水溶液中，获得所述的胸腺类器官微球。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)Transwell小室底部为带孔的透明聚酯膜，所述透明聚酯膜的孔径为5
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10μm。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述胸腺混合细胞是由永生化胸腺上皮细胞与新鲜离体的原代胸腺细胞以细胞数量比10
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50:1混合而成。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述敲低Tβ15b1基因的方法为：将永生化胸腺上皮细胞用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，37℃培养48h至对数生长期，弃原培养液，PBS润洗一次，加入胰酶
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EDTA消化液消化1min后，加入DMEM完全培养基终止消化，800rpm离心5min，收集细胞，用10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种于24孔板，37℃、5％CO2培养箱培养24h，弃去培养液；加入Tβ15b1 shRNA慢病毒、含10％FBS的DMEM完全培养基和溴化己二甲铵，轻吹混匀，在37℃、5％CO2培养箱中病毒感染24h后，用新鲜含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基替换含有病毒的培养基，继续培养72h后，换用含5μg/mL嘌呤霉素和10％FBS的DMEM完全培养基，每1
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2d换新鲜的含有5μg/mL嘌呤霉素和10％FBS的DMEM培养基，培养至无细胞死亡，收集敲低Tβ15b1基因的稳定细胞株；所述Tβ15b1shRNA慢病毒、...

【专利技术属性】
技术研发人员：高建莉，许勰，贺凯，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：