用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型、构建方法及应用技术

用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型构建方法，包括，采用CRISPR/Cas9技术开发的EGE系统制备基因敲进模式小鼠，在小鼠Spic基因后插入EYFP和iCre，并利用P2A进行连接；P2A

【技术实现步骤摘要】
用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型、构建方法及应用


[0001]本申请属于生物化学
，具体涉及用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]铁是人体必需的微量元素，存在于所有细胞内。铁元素在人体内除主要与血红蛋白的合成和与氧气的输送有关外，还参加机体的一些生物化学过程，包括线粒体的电子传递、儿茶酚胺代谢及DNA的合成。此外，约半数参加三羧酸循环的酶和辅酶均含有铁或需铁的存在。铁作为人体必需微量元素，参与调控机体重要生理过程，而且铁稳态代谢的维持受到严密而精细的调控，其稳态代谢对于维护机体健康至关重要，一旦稳态失调将导致铁过载或铁缺乏，均可引发多种疾病如炎症性疾病、恶性肿瘤、贫血等。
[0003]脾、肝和骨髓中的巨噬细胞通过吞噬作用清除衰老红细胞，并在血红蛋白化学分解后从血红素中释放铁。这种高度动态的过程每天回收约25mg铁，占血液中血清总铁的绝大部分。
[0004]现有技术中关于铁代谢相关巨噬细胞的研究主要是基于巨噬细胞膜蛋白CD11b和F4/80的表达，而铁代谢相关巨噬细胞的特征是表达转录因子Spic，现有技术中不能精准追踪铁代谢相关巨噬细胞，没有特异的检测铁代谢相关巨噬细胞的方法。
[0005]所以，精准追踪并研究铁代谢相关巨噬细胞，进一步精准研究其在多种铁代谢异常相关疾病中的作用，并最终用于研发疾病的相关治疗措施具有重要现实意义。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，一方面，一些实施例公开了用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型构建方法，该构建方法包括，采用CRISPR/Cas9技术开发的EGE系统制备基因敲进模式小鼠，在小鼠Spic基因后插入EYFP和iCre，并利用P2A进行连接；P2A
‑
EYFP
‑
P2A
‑
iCre被插入到基因编码区和3
’
UTR之间，通过P2A连接实现EYFP、iCre与本源基因Spic共表达。
[0007]另一方面，一些实施例公开了用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型，由用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型构建方法得到。
[0008]再一方面，一些实施例公开了用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型的应用，以得到的小鼠模型为基础，精准分选铁代谢相关巨噬细胞。
[0009]进一步，一些实施例公开的用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型的应用，精准分选包括：
[0010]对骨髓、脾脏和胎肝细胞磁珠富集F4/80阳性巨噬细胞，再进行F4/80、Ly6G共染；
[0011]利用流式细胞术分选出Ly6G
‑
F4/80
+
Spic
‑
EYFP
+
巨噬细胞即为铁代谢相关巨噬细胞。
[0012]又一方面，一些实施例公开了用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型的应
用，以得到的小鼠模型为基础，构建铁代谢异常疾病模型。
[0013]进一步，一些实施例公开的用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型的应用，以小鼠模型为基础，进行苯肼注射构建溶血性贫血模型。
[0014]一些实施例公开的用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型的应用，以小鼠模型为基础，小鼠放血后构建急性失血性贫血模型。
[0015]一些实施例公开的用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型的应用，以小鼠模型为基础，乏铁饮食构建缺铁性贫血小鼠模型。
[0016]一些实施例公开的用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型的应用，以小鼠模型为基础，注射氯化血红素构建铁过载模型。
[0017]一些实施例公开的用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型的应用，以小鼠模型为基础，续贯注射脂多糖和酵母聚糖A构建炎症性贫血模型。
[0018]本申请实施例公开的用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型具有完整的Spic基因表达,且同时具有Cre酶活性，可以对多种铁代谢相关巨噬细胞标的基因进行基因编辑，EYFP荧光强度显著高于igfp,检测结果重复性高；转录因子spic后插入EYFP和iCre,通过P2A连接实现EYFP、iCre与本源基因Spic共表达，EYFP的存在实现了在不破坏细胞完整性的情况下利用流式细胞术对铁代谢相关巨噬细胞特异性转录因子Spic进行检测，其适用于对正常和疾病模型中铁代谢相关巨噬细胞的快速检测和研究，能大大提高精准性和节约时间；能够利用该小鼠模型在造血器官中对巨噬细胞的多种基因进行编辑切割，研究其功能，特异性强，灵敏度高。
附图说明
[0019]图1、构建新型小鼠模型的打靶策略示意图；
[0020]图2、小鼠模型基因型鉴定结果；
[0021]图3、对分选的WT小鼠和HO小鼠骨髓、脾脏和胎肝巨噬细胞Western Blot检测结果；
[0022]图4、WT小鼠和HO小鼠外周血检测结果；
[0023]图5、WT小鼠和HO小鼠骨髓红系造血祖细胞检测结果；
[0024]图6、WT小鼠和HO小鼠骨髓细胞和骨髓有核红细胞数目检测结果；
[0025]图7、WT小鼠和HO小鼠脾脏细胞以及脾脏Index检测结果；
[0026]图8、小鼠造血器官中Spic
+
巨噬细胞检测结果；
[0027]图9、造血器官中Spic
+
巨噬细胞亚群和Spic
‑
巨噬细胞亚群免疫表型检测结果；
[0028]图10、小鼠模型骨髓、脾脏和胎肝中分别分选的Ly6G
‑
F4/80
+
Spic
‑
EYFP
+
巨噬细胞和Ly6G
‑
F4/80
+
Spic
‑
EYFP
‑
巨噬细胞的吉姆萨染色结果；
[0029]图11、苯肼注射构建溶血性贫血模型Spic
+
巨噬细胞变化的检测结果；
[0030]图12、构建炎症性贫血小鼠模型Spic
+
巨噬细胞变化的检测结果。
具体实施方式
[0031]在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本申请实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方
法。应理解，本申请中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本申请公开的内容。
[0032]除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本申请中其它未特别注明的试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常采用的实验方法和技术手段。
[0033]本文所用的术语“基本”和“大约”用于描述小的波动。例如，它们可以是指小于或等于
±
5％，如小于或等于
±
2％，如小于或等于
±本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型构建方法，其特征在于，该构建方法包括，采用CRISPR/Cas9技术开发的EGE系统制备基因敲进模式小鼠，在小鼠Spic基因后插入EYFP和iCre，并利用P2A进行连接；P2A
‑
EYFP
‑
P2A
‑
iCre被插入到基因编码区和3
’
UTR之间，通过P2A连接实现EYFP、iCre与本源基因Spic共表达。2.用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型，其特征在于，该小鼠模型由权利要求1所述的构建方法得到。3.权利要求2所述的用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型的应用，其特征在于，以所述小鼠模型为基础，精准分选铁代谢相关巨噬细胞。4.根据权利要求3所述的用于精准研究铁代谢相关巨噬细胞的小鼠模型的应用，其特征在于，所述精准分选包括：对骨髓、脾脏和胎肝细胞进行磁珠富集F4/80阳性巨噬细胞，再进行F4/80、Ly6G共染；利用流式细胞术分选出Ly6G
‑
F4/80
+<...

【专利技术属性】
技术研发人员：李威，郭荣群，边志磊，宋永平，许林平，王芳，姜中兴，史健翔，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：