一种重组质粒pMFA42S-Ag85a-IL-17a及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种重组质粒pMFA42S

【技术实现步骤摘要】
一种重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]哮喘是人类呼吸系统最为常见的变态反应性疾病，整体发病率呈现逐年上升的趋势。哮喘反复发作使患者的日常生活受到严重影响，生活质量明显下降，哮喘已然成为严重的社会问题。因此，对哮喘的治疗进行深入研究，寻求新的治疗策略十分必要。
[0003]应用特异性抗体或可溶性受体阻断细胞因子的致炎作用，是目前比较成熟的抗炎靶向治疗策略。目前针对细胞因子的单克隆抗体已被用来治疗如关节炎、变异性脑炎、强直性脊柱炎等多种严重的自身免疫性疾病。抗IL
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17A单克隆抗体也已被用于哮喘治疗的研究中，动物实验研究指出，抗IL
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17A单克隆抗体被动免疫接种哮喘模型小鼠后，能降低小鼠气道中性粒细胞的浸润，但与此同时也增强了机体的Th2型免疫反应，小鼠的BALF中IL
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5、IL
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13等Th2细胞因子的表达水平显著升高，因而治疗效果并不确切，并且单克隆抗体费用较高，往往需要大剂量反复多次注射，限制了其临床应用。
[0004]卡介苗(bacillus Calmette
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Gu
é
rin，BCG)是结核分枝杆菌减毒活疫苗，作为非特异性免疫调节剂，可刺激Th1型免疫反应，抑制Th2型免疫反应，调控Th1/Th2细胞平衡，抑制嗜酸性粒细胞在气道局部的聚集，从而降低气道高反应性，减轻气道炎症。但BCG生长缓慢且构建的重组疫苗质粒表达水平偏低，因而也限制了其应用。
[0005]因此，亟需一种同时兼具有调节Th1/Th2细胞平衡功能，并可通过主动免疫诱导机体产生自身抗体抑制内源性IL
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17A的功能的重组耻垢分枝杆菌疫苗rMS
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Ag85a
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IL
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17a。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a及其构建方法与应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0008]本专利技术的第一方面是提供一种重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a，所述重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]测序结果如下表所示：
[0010][0011]本专利技术的第二方面是提供一种上述重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a的构建方法，步骤包括：
[0012]步骤A1、PCR扩增目的基因Ag85a
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IL
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17a；
[0013]步骤A2、分别酶切所述目的基因Ag85a
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IL
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17a以及质粒pMFA42S；
[0014]步骤A3、连接所述目的基因Ag85a
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IL
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17a与所述质粒pMFA42S，即得所述重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a。
[0015]优选地，步骤A1中，所述目的基因Ag85a
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IL
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17a的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述目的基因Ag85a
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IL
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17a的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0016]更优选地，步骤A1中，所述PCR扩增的反应体系包括：
[0017][0018][0019]优选地，步骤A1中，PCR扩增目的基因Ag85a
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IL
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17a后，分离纯化所述目的基因Ag85a
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IL
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17a。
[0020]优选地，步骤A2中，酶切所述目的基因Ag85a
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IL
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17a以及质粒pMFA42S时，所采用的酶均为BamH I以及Sal I。
[0021]更优选地，步骤A2中，所述酶切质粒pMFA42S的反应体系包括：
[0022][0023]优选地，步骤A3中，所述连接的反应体系包括：
[0024][0025]本专利技术的第三方面是提供一种上述重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a在构建重组耻垢分枝杆菌疫苗中的应用。
[0026]优选地，所述重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建步骤包括：
[0027]步骤B1、制备耻垢分枝杆菌感受态细胞；
[0028]步骤B2、电转化所述重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a至所述耻垢分枝杆菌感受态细胞中，即得所述重组耻垢分枝杆菌疫苗。
[0029]本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0030]本专利技术以大肠杆菌
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分枝杆菌穿梭表达载体pMFA系列中的pMFA42S为载体，构建重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a，采用电转化技术将重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a转入耻垢分枝杆菌中，构建表达融合蛋白Ag85A
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IL
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17A的重组耻垢分枝杆菌疫苗rMS
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Ag85a
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IL
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17a。上述疫苗同时兼具有调节Th1/Th2细胞平衡功能，并可通过主动免疫诱导机体产生自身抗体抑制内源性IL
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17A的功能，实验周期短，方法经济，且仅需要2次接种，具有较强的实用性。
附图说明
[0031]图1为重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a的构建流程示意图；
[0032]图2A为巨噬细胞凋亡率的比较结果；图2B为细胞培养上清中NO浓度测定结果；
[0033]图3A为小鼠第28天血清稀释液OD值测定结果；图3B为小鼠血清1:100稀释后不同时间点血清中抗体滴度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a，其特征在于，所述重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种如权利要求1所述重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a的构建方法，其特征在于，步骤包括：步骤A1、PCR扩增目的基因Ag85a
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IL
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17a；步骤A2、分别酶切所述目的基因Ag85a
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IL
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17a以及质粒pMFA42S；步骤A3、连接所述目的基因Ag85a
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IL
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17a与所述质粒pMFA42S，即得所述重组质粒pMFA42S
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Ag85a
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IL
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17a。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤A1中，所述目的基因Ag85a
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IL
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17a的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述目的基因Ag85a
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IL
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17a的下游引物核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈凌，茅松，石文静，徐敏，朱若尘，
申请(专利权)人：上海市第六人民医院，
类型：发明
国别省市：