抗Xa测定试剂盒(发色底物法)制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及抗Xa测定试剂盒(发色底物法)。本发明专利技术试剂盒采用特定的稳定剂体系搭配试剂盒中其他组分，使得所述试剂盒在保证检测结果准确可靠的情况下，37℃热稳定性明显优于现有试剂盒，可常温储存，储存期更长。本发明专利技术提供的检测方法操作过程简便，仅需要建立一条校准曲线即可测试不同种类的肝素，包括普通肝素和低分子量肝素，两者建立的校准曲线是重合的。立的校准曲线是重合的。立的校准曲线是重合的。

【技术实现步骤摘要】
抗Xa测定试剂盒(发色底物法)


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及抗Xa测定试剂盒(发色底物法)。

技术介绍

[0002]Xa(活化凝血因子X)是体内参与凝血过程的重要因子，是一种胰蛋白酶 样丝氨酸蛋白酶，同时作用于内源和外源两条凝血途径。Xa参与凝血的原理 是其与Va(活化凝血因子V)和磷脂表面的钙离子结合后，催化凝血酶原转化 成凝血酶，凝血酶进一步激活血小板，同时将纤维蛋白原转化成纤维蛋白， 最终导致凝血。具有抗Xa活性的主要有肝素(普通未分级肝素UFH和低分子 量肝素LMWH)、磺达肝素及Xa的直接抑制剂(利伐沙班、阿哌沙班和依度 沙班等)。目前临床上抗凝治疗使用的抗凝药物多以肝素类抗凝剂为主。肝 素是一种由葡萄糖胺，L
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艾杜糖醛苷，N
‑
乙酰葡萄糖胺和D
‑
葡萄糖醛酸交替 组成的黏多糖硫酸脂，是应用最广泛的抗凝剂之一。肝素在凝血系统中的主 要作用就是增强抗凝血酶III(AT
‑
III)的生物活性，同时抑制Xa，发挥抗凝作 用。普通未分级肝素，平均分子量在15000Da，可从猪和牛的肺组织中提取得 到，其在治疗过程中，会引起两种已知的副作用(骨质疏松症及肝素诱导的 血小板减少症)，故需对其进行监测；低分子量肝素LMWH，是由普通未分 级肝素经过各种解聚方法得到，平均分子量在4000～6000Da，其抑制Xa的有效 剂量明显低于UFH，同时具有生物利用度高，抗血栓作用强及对凝血系统影 响小，副作用少等特点，但由于低分子量肝素的清除主要在肾脏，因此对于 孕妇、肥胖者、儿童、老人和患有肾脏疾病或肾功能障碍的肝素治疗患者也 需进行监测。故研究准确检测肝素含量的方法具有很高的临床应用价值。
[0003]目前，检测肝素抗Xa活性的主要方法有凝固法和发色底物法，应用最广 泛的是发色底物法，近年来也更倾向于发色底物法。发色底物法测定肝素抗 Xa活性的原理是，肝素与血浆中的抗凝血酶III(AT
‑
III)结合形成复合物，抑 制Xa活性，Xa与其特异性底物反应，释放出染料，该染料在405nm处有最大 吸收峰，可通过吸光值进而计算肝素抗Xa活性。发色底物法又细分两种，一 种是两步法，另一种是一步法。两步法原理是肝素与AT
‑
III结合与Xa反应，然 后Xa再与其特异性底物反应，中国专利CN103063592A、CN103323416A、 CN105203479A及CN107091814A是采用这种原理；一步法是肝素与AT
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III结合 后，先加底物，再加Xa，底物与肝素
‑
AT
‑
III复合物不反应，待加入Xa后，肝 素
‑
AT
‑
III复合物抑制Xa及Xa与特异性底物结合这两个反应同时发生，中国专 利CN104062243A和CN108195783A是采用这种原理。
[0004]Xa因子在液体状态下不稳定，大多数采用冻干技术，由于冻干工艺较为 复杂，容易造成批间差大，使不同批次试剂的检测结果差异大。中国专利 CN107091814A公布了一种液体即用型血液肝素浓度的试剂，其为液体试剂， 开瓶即用，无需复溶，使用方便，但稳定时间仍不够长，37℃下仅可稳定21 天，并且测试过程较为繁琐，测试不同种类的肝素均需要建立相应的标准曲 线。中国专利CN108195783A公布了一种肝素活性测定试剂盒，虽然具有热稳 定性，但是热稳定时间较短，仅有14天。故，目前的技术中仍然存在测试繁 琐，热稳
定性低的问题。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术目的在于提供一种热稳定性好、检测结果准确可 靠的抗Xa测定试剂盒及检测方法。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]抗Xa测定试剂盒，由R1试剂和R2试剂组成；
[0008]所述R1试剂由发色底物、缓冲剂、稳定剂和防腐剂组成，其中，所述稳 定剂选自棉子糖、牛血清白蛋白、壬基酚聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮及十 二烷基二甲基氧化胺中的一种或几种；
[0009]所述R2试剂由Xa因子、缓冲剂、抗凝剂、无机盐、稳定剂、防腐剂组 成；其中，所述稳定剂为羟乙基淀粉、羧甲基纤维素钠、牛血清白蛋白、曲 拉通X
‑
100、抑肽酶、十四烷基三甲基溴化铵、聚山梨酯、聚乙烯醇、正缬氨 酸、甜菜碱中的一种或几种。
[0010]一些实施方案中，所述R1试剂中，稳定剂由棉子糖、壬基酚聚氧乙烯醚 和聚乙烯吡咯烷酮组成。具体地，在所述的R1试剂中稳定剂中各组分的浓度 优选为：1～5％(w/v)的棉子糖、0.01～2％(w/v)的壬基酚聚氧乙烯醚和 0.1～2％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮，进一步优选为2％(w/v)棉子糖，0.1％(w/v)壬 基酚聚氧乙烯醚和1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮。
[0011]本专利技术中，所述R1试剂组成为：
[0012]1～5mM发色底物、20～100mM缓冲剂、1～5％的棉子糖、0.01～2％的壬基 酚聚氧乙烯醚和0.1～2％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮和0.015～1.05％(w/v)防腐剂。
[0013]其中，发色底物为Suc
‑
Ile
‑
Glu
‑
(γ
‑
Piperidyl)
‑
Gly
‑
Arg
‑
pNA
·
HCl(S
‑
2732) 或Z
‑
D
‑
Arg
‑
Gly
‑
Arg
‑
pNA
·
HCl(S
‑
2765)，优选浓度为1～5mMS
‑
2732，更优 选为1.5mMS
‑
2732；
[0014]缓冲剂选自咪唑、Tris
‑
HCl、磷酸盐、HEPES中的一种或几种，pH为5～7， 优选pH5～7的20～100mM的咪唑，更优选为pH为6的50mM的咪唑；
[0015]防腐剂选自叠氮钠、ProClin300、环丙沙星、青霉素、生物防腐剂Krovin300 中的一种或几种，优选0.01～1％(w/v)叠氮钠和0.005～0.05％(w/v)环丙沙星的组 合，更优选为0.05％(w/v)叠氮钠和0.01％(w/v)环丙沙星的组合。
[0016]一些实施方案中，所述R2试剂中，稳定剂由羟乙基淀粉、牛血清白蛋白、 聚乙烯醇和正缬氨酸组成。在所述的R2试剂中稳定剂中各组分的浓度优选为： 0.01％～1％(w/v)羟乙基淀粉、1～5％(w/v)牛血清白蛋白、1～5％(w/v)聚乙烯醇和 1～5％(w/v)正缬氨酸，进一步优选为0.5％(w/v)羟乙基淀粉、3％(w/v)牛血清白 蛋白、2％(w/v)聚乙烯醇和3％(w/v)正缬本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗Xa测定试剂盒，其特征在于，由R1试剂和R2试剂组成；所述R1试剂由发色底物、缓冲剂、稳定剂和防腐剂组成，其中，所述稳定剂选自棉子糖、牛血清白蛋白、壬基酚聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮及十二烷基二甲基氧化胺中的一种或几种；所述R2试剂由Xa因子、缓冲剂、抗凝剂、无机盐、稳定剂、防腐剂组成；其中，所述稳定剂为羟乙基淀粉、羧甲基纤维素钠、牛血清白蛋白、曲拉通X
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100、抑肽酶、十四烷基三甲基溴化铵、聚山梨酯、聚乙烯醇、正缬氨酸、甜菜碱中的一种或几种。2.根据权利要求1所述的抗Xa测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，稳定剂由棉子糖、壬基酚聚氧乙烯醚和聚乙烯吡咯烷酮组成。3.根据权利要求1所述的抗Xa测定试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中，稳定剂由羟乙基淀粉、牛血清白蛋白、聚乙烯醇和正缬氨酸组成。4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂组成为：1～5mM发色底物、20～100mM缓冲剂、1～5％(w/v)的棉子糖、0.01～2％(w/v)的壬基酚聚氧乙烯醚和0.1～2％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮和0.015～1.05％(w/v)防腐剂。5.根据权利要求1～4任一项所述的抗Xa测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中：发色底物为Suc
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Ile
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Glu
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(γ
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Piperidyl)
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Gly
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Arg
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pNA
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HCl或Z
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D
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Arg
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Gly...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢永华，郑苗，
申请(专利权)人：上海太阳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：